诸氏鲻虾虎鱼多态性微卫星标记的开发及评价

目的开发诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)多态性微卫星标记,为诸氏鲻虾虎鱼的遗传背景评价提供基础数据。方法采用磁珠富集法,以生物素标记的(AC)15为探针,构建了诸氏鲻虾虎鱼微卫星富集文库。经克隆、筛选、测序后,设计合成微卫星引物,利用野生群体对微卫星引物进行多态性筛选和评价。结果共获得74个含有微卫星重复单元的序列,根据微卫星序列共设计出33对微卫星引物。利用30个野生诸氏鲻虾虎鱼样本对33对引物的微卫星位点进行了评价,其中有12个位点表现出多态性,平均有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态信息含量(PIC)分别为2.9167、2.2311、0.4583、0.5633和0.4474。结论所筛选的微卫星标记将为诸氏鲻虾虎鱼遗传质量控制及监测提供实验依据。     

东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选

目的 从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星.方法 应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记.结果 以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆.再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55％.选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性.结论 成功且高效地从阳性BAC克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性BAC克隆可用于后续的定位研究.     

青鱼微卫星标记的开发与特性分析

青鱼(Mylopharyngodon piceus)是中国最为重要的淡水养殖鱼类。开发青鱼的微卫星标记能为青鱼的遗传多样性分析提供更多工具。本研究使用磁珠富集法,利用生物素探针(CA)10和(GACA)6,富集得到青鱼基因组微卫星片段,进一步通过设计微卫星引物检验其在青鱼原种群体中的有效性和多态性水平。结果显示,所构建文库中849个克隆含有微卫星序列,通过利用PCR技术在吴江原种青鱼36个个体中进行多态性筛选,获得了25个多态性微卫星位点。其平均等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)分别为7.08和3.526,平均观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.602和0.619,平均多态信息含量(PIC)为0.568。其中,Mp23、Mp27和Mp35这3个位点极显著偏离哈迪-温伯格平衡(P 0.01)。本研究开发的微卫星标记能为青鱼种质资源的评价和保护等研究提供工具。     

牦牛基因组微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理,用链亲和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)12、(CCG)8、(CAG)8、(TTTC)8退火结合的含有接头和牦牛微卫星序列的单链限制性酶切片段,获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建牦牛基因组微卫星富集文库。测序结果发现,阳性克隆率为77％(37／48),说明构建的牦牛基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库。牦牛富集微卫星文库的建立和牦牛微卫星的筛选将为下一步进行牦牛基因组结构的分析、牦牛遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究、标记辅助选择以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。     

两种书虱微卫星富集文库的构建及比较

利用链霉亲和素与生物素之间的强亲和性原理,将链霉亲和素偶联的磁珠与微卫星探针(AC)12、(TC)12、(ATC)8、(ATG)8、(AAC)8、(ATAC)6及(GATA)6退火结合后,再亲和捕捉含接头和微卫星序列的单链书虱基因组DNA限制性酶切目的片段,经PCR扩增形成双链后进行克隆、建库。结果表明本研究成功构建了嗜卷书虱和嗜虫书虱共13个微卫星富集文库,包括6个嗜卷书虱文库,7个嗜虫书虱文库,其平均阳性克隆率为71.17%。经检测发现共得到两种书虱260个微卫星位点。这两种书虱微卫星富集文库的建立和高多态性微卫星位点的筛选将为嗜卷书虱和嗜虫书虱的种群遗传与进化、基因连锁图谱构建、分子系统发育研究等提供大量分子遗传标记,对其在实仓中的持续控制提供遗传学信息。     

从松属相关物种筛选红松微卫星标记及其种群遗传多样性分析

近缘物种筛选法是获取微卫星引物的主要方法之一。利用松属植物EST-SSRs的种间通用性,从马尾松微卫星引物中筛选出红松EST-SSR标记,并与已有的红松基因组SSR标记进行对比分析。采集长白山露水河红松母树林4个种群的248个样本,分析种群遗传多样性。结果表明:马尾松与红松的种间通用率为27.27%,松属内不同亚属物种间的种间通用性偏低;与红松基因组SSRs相比,EST-SSRs的单位点等位基因数(N a)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)等遗传多样性参数均较低;用2组引物分析4个种群的遗传多样性,发现有效等位基因均能反映出不同种群遗传变异的趋势,基因多样性均能反映出遗传同一性的差异,说明两组引物都能准确地反映红松种群的遗传多态性水平,新筛选的EST-SSRs可以用于红松种群遗传多样性研究。     

东方粘虫(Pseudaletia separata(Walker))微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理,用包被链亲和素的磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)15、(GA)15、(GTT)12、(GAT)12、(TAGA)8 和 (GTGA)8退火结合的含接头和微卫星序列的单链粘虫基因组DNA限制性酶切片段,获得单链目的片段.经PCR扩增形成双链后连接到pGEM-T 载体上,再转化到DH5α热感受态细胞中,首次成功构建粘虫基因组微卫星富集文库.随机抽样(16次抽样,每库共12～114个克隆)测序发现,6个文库总的微卫星阳性克隆率30.07%,CA/GAT/GTT 等3个文库的阳性克隆率达到40%以上.单次抽样最高阳性克隆率达到56%.粘虫微卫星富集文库的建立和高多态性微卫星单拷贝位点的筛选将为粘虫的生态遗传学研究、连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究等提供大量遗传标记,对昆虫迁飞的分子生态研究也有重大意义.     

藏酋猴微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

通过磁珠富集法构建了藏酋猴AC重复和AAAG重复的微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析。将藏酋猴基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头。用生物素标记的探针与酶切片段杂交,捕获300～1000bp片段,随后将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至JM109中,成功构建藏酋猴微卫星富集文库。(AC)n富集文库和(AAAG)n富集文库的阳性克隆率分别为50%和10%左右。根据测序得到的48个微卫星序列成功设计了24对引物,最终筛选出6个微卫星标记,这些标记将为藏酋猴的遗传多样性研究、圈养种群结构的分析和遗传图谱的构建等奠定一定的基础。     

云南松基因组微卫星富集文库的构建

采用磁珠富集法构建云南松微卫星富集文库。云南松基因组DNA经RsaⅠ酶切,与特定接头连接,再用接头特异引物进行PCR扩增。连接扩增产物与用生物素标记的(AG)12、(AT)12、(CG)12、(GT)12、(ACG)12、(ACT)12和(CCA)8探针杂交,通过链霉亲和素偶联的磁珠捕捉含接头和微卫星序列的片段并扩增,将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,成功构建了云南松微卫星富集文库。通过PCR检测从文库中筛选阳性克隆,在383富集阳性菌落中获得阳性克隆257个,经测序分析,在获得的159条序列中,有143条含有SSR,其中完美型占65.73%,非完美型占23.78%,混合型占10.49%。结果表明,磁珠富集法构建云南松基因组微卫星文库高效、可行的,文库的构建为微卫星位点的分离、遗传多样性的分析等奠定基础。     

三角帆蚌四核苷酸重复微卫星的开发及特征分析

用磁珠富集法和生物素标记(ATAC)5为探针构建了三角帆蚌基因微卫星富集文库。利用PrimerSelect软件对得到的微卫星序列进行引物设计并合成得到43对引物,初筛后发现有20对引物可以扩增出稳定、清晰的目的产物带。荧光标记这20对引物,然后用36只洞庭湖三角帆蚌扩增,发现17对引物呈现多态性。17个微卫星位点等位基因数的范围为6-28。期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)的范围分别为0.677 6-0.946 4、0.638 9-1.000 0。多态信息含量(PIC)在0.630-0.929之间。统计分析结果显示,其中有12个微卫星位点满足Hardy-Weinberg平衡条件。与本实验室之前开发的二核苷酸重复微卫星相比,该17对四核甘酸重复微卫星具有更高多态性,且更易于采用聚丙烯酰胺凝胶电泳等传统方法分析基因型,有利于节约成本,从而为三角帆蚌群体遗传分析、亲子鉴定等技术提供了准确、价格低廉的微卫星标记。     

背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征

利用磁珠富集法筛选背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的微卫星分子标记,采用Sau3A1酶对完整DNA进行酶切,以生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从酶切片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PGEM-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过菌液PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.结果表明:在筛选的18...     

巴氏蘑菇微卫星序列的分离及其对Co60辐射诱变菌株的鉴别

根据链霉素磁珠和生物素特异结合的特性,用生物素标记的二聚核苷酸重复序列探针从巴氏蘑菇的基因组中分离微卫星序列。将结合于链霉素磁珠上的标记探针同两端连接已知序列人工接头的巴氏蘑菇DNA酶切片段杂交。洗脱未杂交DNA片段后,用磁珠富集的片段建立微卫星文库。挑取522个菌落用对应重复序列为引物进行PCR筛选,得到48个阳性克隆,经测序有32个菌落含微卫星序列。微卫星富集效率为阳性克隆数的67%,总克隆数的6%。除去重复或无效的微卫星序列,在设计出的12对用于鉴别85个巴氏蘑菇的Co60辐射变异株微卫星引物中,有4对引物总共扩增出明显的变异菌株17个。证明有些微卫星位点可用于巴氏蘑菇辐射变异品种的指纹筛选与鉴别。     

伊犁鲈微卫星位点的筛选及近缘物种通用性

为开发伊犁鲈(Perca schrenkii)分子标记用于鲈属鱼类种质资源保护,以伊犁鲈为材料,应用磁珠富集法进行了微卫星标记的筛选.从伊犁鲈尾鳍提取总DNA,进行酶切、接头连接、PCR扩增,再采用生物素标记(CA)15探针及生物素标记(TG)15探针对扩增产物进行杂交富集,经再次PCR扩增及T-A克隆,成功构建了伊犁鲈基因组微卫星富集文库.采用重复序列引物筛选获得阳性克隆,随机选取48个阳性克隆进行测序,测得序列46个,其中38个克隆含有微卫星序列,41个位点的微卫星重复数在8次以上.根据测得序列设计17对微卫星引物,均能在伊犁鲈群体中扩增获得目的条带.采用该17对引物对河鲈(P.fluviatilis)及黄金鲈(P.flavescens)群体样本进行扩增,10对引物具有通用性,其中6对在河鲈中具有高度多态性(PIC>0.5),5对在黄金鲈中具有高度多态性.     

A Modified Enrichment Method to Construct Microsatellite Library from Plateau Pika Genome （Ochotona curzoniae）

A microsatellite-enriched library of plateau pika(Ochotona curzoniae)was constructed according to the strong affinity between biotin and streptavidin.Firstly,genomic DNA was fragmented by ultrasonication,which is a major improvement over traditional methods.Linker-ligated DNA fragments were hybridized with biotinylated microsatellite probes,and then were subjected to streptavidin-coated magnetic beads.PCR amplification was performed to obtain double-stranded DNA fragments containing microsatellites.Ligation and transformation were carried out by using the pGEM-T Vector System Ⅰ and Escherichia coli DH10B competent cells.Sequencing results showed that 80.2% of clones contained microsatellite repeat motif.Several modifications make this protocol time-efficient and technically easier than the traditional ones; particularly,composition and relative abundance of microsatellite repeats in plateau pika genome were truly represented through the optimized PCR conditions.This method has also been successfully applied to construct microsatellite-enriched genomic libraries of Chinese hamster(Cricetulus griseus)and small abalone[Haliotis diversicolor(Reeve)]with high rates of positive clones,demonstrating its feasibility and stability.     

Molecular-genetic analysis of wheat (T. aestivum L.) genome with introgression of Ae. cylindrica Host genetic elements

Wheat-aegilops hybrid plants Triticum aestivum L. (2n = 42) x Aegilops cylindrica Host (2n = 28) were investigated with using microsatellite markers. In two BC1F9 lines some genome modifications connected with losing DNA fragments of initial variety or appearing of Aegilops genome elements were detected. In some investigated hybrids new amplicons lacking in parental plants were found. Substitution of wheat chromosomes for aegilops chromosomes was not revealed. Analysis of microsatellite loci in BC2F5 plants showed stable introgression of aegilops genetic elements into wheat; elimination of some transferred aegilops DNA fragments in the course of backcrossing; decreasing size of introgressive elements after backcrossing. Introgressive lines were classified according to genome changes.     

Microsatellite loci from the house wren (Troglodytes aedon)

We cloned seven microsatellite loci from house wrens (Troglodytes aedon) using a biotin enrichment protocol. Starting with fragments generated using DOP–PCR, fragments containing microsatellite motifs AC and AAC were captured using biotinylated probes and streptavidin coated magnetic particles. Captured fragments were cloned into plasmids; prior to sequencing, the plasmids were screened for microsatellites using a simple PCR approach. Five of the loci showed variation in a sample of nine individuals.     

用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星DNA标记

将花生(Arachis hypogaea L．)基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再进行克隆和测序,根据SSR两端的保守序列设计引物,经过多态性分析后,便可得到微卫星DNA标记。整个实验过程操作简单、消耗少,可在一周内完成,可作为从植物中分离SSR的一种简单有效的方法。     

Identification, cloning, and characterization of microsatellite DNA in Euglena gracilis

Microsatellite DNA has been developed into one of the most popular genetic markers. We have identified and cloned microsatellite loci in the genome of a free-living protozoan Euglena gracilis FACHB-848, using the random amplified microsatellites method (RAMS). The digoxigenin-labelled oligonucleotides (CT)10 and (GT)10 served as probes to detect complementary sequences in the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprints produced by means of Southern blotting. Subsequently, positive RAPD fragments were cloned. From a total of 31 RAPD primer profiles, eight microsatellite loci of E. gracilis were detected and characterized. Further, six sites (i.e. EGMS1, EGMS3, EGMS4, EGMS5, EGMS6, and EGMS7) showed polymorphisms. We found a GT or CT microsatellite every 10.5 kb in the genome of E. gracilis, and similar to animal genomes, the (GT)(n) motif was much more abundant than the (CT)(n) motif. These polymorphic microsatellite DNA will serve as advantageous molecular markers for studying the genetic diversity and molecular ecology of Euglena.     

Families of clustered microsatellites in a conifer genome

Microsatellite clustering may account for genetic maps which do not coalesce into the expected number of linkage groups. Microsatellite organization within the large genome of Pinus taeda (1C = 20,000 Mb) was determined by (1) testing whether repeat motifs were sequestered within the low-copy DNA kinetic component and (2) testing for repeat motif clusters within DNA fragments regardless of copy number. Within the low-copy kinetic component, either (AC)n or (AG)n repeat units were present in 32% of sequences. No repeat motifs were found in the total genome control. Clustered repeat motifs were frequent; the (ATG)n triplet repeat motif was located upstream from a CG-rich trinucleotide microsatellite in 26 out of 44 microsatellite sequences. Fourteen of the clustered (ATG)n sequences could be assembled into four microsatellite sequence families based on similarities in the flanking regions. Consistent with the DNA turnover model, family members shared similar flanking regions but differed in repeat motif composition and length.     

豚鼠基因组26个多态性微卫星标记的筛选

目的筛选豚鼠基因组的多态性微卫星标记,为豚鼠遗传质量控制及基因定位等工作奠定基础。方法采用磁珠富集法和豚鼠基因组数据库筛选法获取微卫星位点序列,通过分析和初步筛选,挑选部分候选位点,根据其序列设计引物,对5种不同来源的豚鼠基因组DNA标本进行PCR扩增,以期获得多态性分子标记。结果本实验采用磁珠富集法共获得微卫星序列304个,设计引物125对,最终获得多态性位点1个,暂未发现多态性的特异性位点17个;用数据库筛选法共获得微卫星序列292个,设计并合成相应引物178对,最终发现多态性位点25个,暂未发现多态性的特异性位点28个。结论本实验获得26个多态性微卫星标记,45个潜在的候选标记,为微卫星标记在豚鼠遗传质量监测及突变基因定位等工作的应用奠定了基础。