ATP合酶旋转催化的一种新机制

ATP合酶利用跨膜离子(主要是质子)梯度提供的能量,催化由ADP和Pi(磷酸)合成ATP的反应.已有证据表明,这种催化反应通过ATP合酶内部亚基之间的相对旋转而实现.然而,现有的基于整合在细胞膜内的c环及附着于其上的中心杆(由?和?亚基组成)转动的ATP合酶旋转模型存在多方面的理论缺陷,也与某些实验数据不符.本文提出了一种新的ATP合酶旋转催化模型,其中发生旋转的是?3?3六聚体.具体而言,质子的跨膜转运引起c环的周期性构象改变,从而使得附着在c环上的中心杆产生往复运动,这种往复运动驱动?3?3六聚体的连续转动.这种工作模式与按压式伸缩圆珠笔中推杆的往复运动驱动凸轮产生连续转动的工作机理十分相似.新模型不仅避免了现有模型的理论缺陷,而且更好地解释了已有实验数据.     

高等植物叶绿体ATP合酶ε亚基的结构与功能

ε亚基是叶绿体ATP合酶最小的一个亚基,有阻塞ATP合酶的质子通道和抑制其水解ATP活力的两种功能.用定点突变和缺失等分子生物学方法对ε亚基的结构功能进行了研究,结果表明:ε亚基42位上的苏氨酸(Thr42)对维持其结构和功能都很重要.与大肠杆菌ATP合酶相比,叶绿体ATP合酶ε亚基C端和N端的氨基酸残基缺失对其结构功能的影响更为敏感.     

高等植物叶绿体ATP合酶ε亚基的结构与功能

ε亚基是叶绿体ATP合酶最小的一个亚基,有阻塞ATP合酶的质子通道和抑制其水解ATP活力的两种功能。用定点突变和缺失等分子生物学方法对ε亚基的结构功能进行了研究,结果表明：ε亚基42位上的苏氨酸(Thr42)对维持其结构和功能都很重要。与大肠杆菌ATP合酶相比,叶绿体ATP合酶ε亚基C端和N端的氨基酸残基缺失对其结构功能的影响更为敏感。     

淡色库蚊ATP合酶B亚基基因克隆和序列分析及其与溴氰菊酯抗性的关系

【目的】克隆淡色库蚊Culex pipiens pallens ATP合酶B亚基基因编码区序列,并进行生物信息学分析,研究其与溴氰菊酯抗性关系。【方法】通过PCR方法扩增ATP合酶B亚基基因编码区序列;利用生物信息学网站在线分析工具,预测ATP合酶B亚基基因编码蛋白的理化性质和功能特征;通过实时定量PCR方法比较ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系和抗性品系中的表达,并在现场种群溴氰菊酯敏感和抗性个体中做进一步验证。【结果】成功克隆淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列(Gen Bank登录号:KY783434),长717 bp,编码238个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白理论相对分子量为26.96 k D,等电点为8.97,在第70-231位氨基酸具有ATP合酶B亚基结构域,未发现信号肽和跨膜区。实时定量PCR结果显示,ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和现场种群溴氰菊酯抗性个体中表达量均上调。【结论】本研究获得了淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列,进行了生物信息学分析,并证实其在溴氰菊酯抗性个体中高表达,为进一步研究该基因在蚊抗药性中的作用奠定了基础。     

蚕豆和玉米叶绿体atpE基因表达产物的生物活性差异及次级结构分析

编码蚕豆和玉米叶绿体ATP合酶ε亚基的atpE基因分别在大肠杆菌中获得了高效表达 ,两种表达的ε亚基蛋白分别与来自蚕豆、玉米和菠菜的缺失ε亚基的CF1重组后 ,发现玉米的ε亚基蛋白在抑制CF1 ATP酶水解ATP、阻塞类囊体膜质子通道以及它促进光合磷酸化等方面均明显地强于蚕豆的ε亚基蛋白。该结果表明 :( 1)ε亚基对ATP合酶活性的调节作用与其同ATP合酶其他亚基间的亲和力大小密切相关 ;( 2 )ε亚基抑制CF1水解ATP和阻塞质子通道两个功能是呈正相关的。圆二色性 (circulardichroism)的分析结果表明 ,玉米CF1ε亚基的 4种二级结构比例为α 螺旋 2 2 .6% ,β 折叠 3 0 .6% ,β 转角 9.3 % ,无规则结构 3 7.7% ;蚕豆CF1ε亚基的 4种二级结构比例为α 螺旋 3 1.4 % ,β 折叠 2 2 .3 % ,β 转角 13 .8% ,无规则结构 3 2 .4 %     

砂藓ATP合酶Ⅱ亚基基因的克隆及表达分析

ATP合酶是光合作用中光合磷酸化和呼吸作用中氧化磷酸化反应的关键酶,影响着细胞生命活动所需的ATP的产生。为研究ATP合酶在苔藓植物中的生物学功能,本研究克隆得到砂藓ATP合酶Ⅱ亚基基因,命名为Rcatp G。生物信息学分析表明,砂藓的c DNA序列长为1 220 bp,其中开放阅读框(ORF)为756 bp,编码251个氨基酸的多肽序列;预测分子质量为27.48 k D,等电点为9.20,含有ATP-synt_B保守结构域;推测Rcatp G蛋白为不稳定蛋白,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发育分析显示,Rcatp G蛋白与小立碗藓atp G蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Rcatp G基因在复水过程和脱水胁迫处理中均能表达。因此,推测Rcatp G基因在砂藓的复水过程和脱水胁迫处理中起着一定的作用。     

酵母线粒体ATP合酶生物合成及组装机制研究进展

线粒体ATP合酶是线粒体氧化磷酸化的关键酶,其功能缺陷会导致能量代谢障碍相关的线粒体疾病。线粒体ATP合酶是由多个亚基组成的蛋白复合物,其生物合成和组装是个复杂的生物过程。酵母是研究线粒体ATP合酶结构、生物合成和组装机制的模式实验材料之一,且相关研究取得了很多进展。本文概述了国内外用酿酒酵母研究线粒体ATP合酶的结构、调控线粒体ATP合酶亚基生物合成和组装的辅助蛋白及合酶的模块化组装过程的研究进展,以期为线粒体ATP合酶的工作机制及相关线粒体疾病的研究提供理论借鉴和参考依据。     

简述几个酶学概念

单体酶（monomericenzyme）、寡聚酶（oligomeri－cenzyme）、多酶复合体（muhltienzymecomplex）、多酶融合体（multienzymeconjugate）等概念之间存在着交叉和重叠现象,本文对其进行了简述。1单体酶由一条肽链组成或由多条肽链组成,但肽链间以共价键结合的酶。例如牛胰核糖核酸酶是由含124个氨基酸残基的一条肽链组成。又例如胰凝乳蛋白酶是由3条肽链组成,队链间由二硫键相连构成一个共价整体。这类合几条肽链的单体酶往往是由一条前体肽链经活化断裂而生成。2寡聚酶由2个或2个以上亚基组成的酶,亚基间以非共价键结合。从结构上看,酶…     

酿酒酵母ATP合酶δ亚基融合蛋白的构建、表达及生物学功能分析

利用分子克隆手段构建了酿酒酵母ATP合酶δ亚基和流感病毒血凝素(haemagglutinin, HA)标签融合蛋白的表达质粒.该融合蛋白在酿酒酵母细胞中能够正常表达,而且能够互补编码δ亚基的ATP16基因缺失株在利用非发酵性碳源方面的表型缺陷,表明该融合蛋白具有野生型δ亚基的功能.同时,构建了在大肠杆菌细胞中表达该δ亚基的ScAtp16p-His6融合蛋白,并用纯化的融合蛋白在家兔中制备了其多抗血清.结果表明此多抗可以很好地与ScAtp16p-His6和HA-ScAtp16p两种融合蛋白特异性结合.这些研究材料的获得为深入研究ATP合酶的解偶联机制和磷酸化调控机理奠定了基础.     

ATP合酶的结构与催化机理

ATP合酶 (F1Fo 复合物) 是生物体内进行氧化磷酸化和光合磷酸化的关键酶.随着核磁共振、X射线晶体衍射、遗传学、化学交联等技术在ATP合酶研究中的广泛应用,ATP合酶的整体结构及其各组成亚基结构的研究都有很大的进展.其中细菌ATP合酶结构的研究更为深入.目前对质子通过Fo的转运方式提出两种模型:单通道和双半通道模型.对扭力矩的形成以及旋转催化也有了进一步的认识.Boyer提出的结合改变机理推动了ATP合酶催化机制的研究,现在主要有两点催化机制和三点催化机制.ATP合酶的催化反应受酶的构象变化和外在条件的调节.     

HCVIRES介导萤火虫荧光素酶翻译的双顺反子载体的构建与在小鼠体内的表达

将HCVIRES插入双报告基因海肾荧光素酶 (Rluc)基因和萤火虫荧光素酶 (Fluc)基因之间 ,建立了“依赖帽子的扫描机制”翻译表达Rluc ,HCVIRES调控Fluc翻译的双顺反子表达载体pCI Rluc HCVIRES Fluc ,通过酶切反应及转染HepG2细胞鉴定双荧光素酶瞬间表达活性等试验 ,证实获得了表达双荧光素酶的双顺反子载体 .并应用水压转染法将双顺反子表达质粒导入小鼠体内 ,在小鼠肝脏检测到高水平表达的Rluc和Fluc .该研究成功构建一种HCVIRES介导萤火虫荧光素酶基因表达的双顺反子载体 ,并在HepG2细胞及小鼠体内进行了瞬时表达 ,为进一步建立稳定评价靶向HCVIRES药物作用的细胞及小动物模型研究奠定了基础     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

苦皮藤素V对东方粘虫中肠V-ATP酶AB亚基复合物水解ATP活性的抑制作用北大核心CSCD

苦皮藤素V是一种对昆虫具有毒杀活性的化合物,从植物苦皮藤(Celastrus angulatus Max)中分离出来。目前,已发现苦皮藤素V可与粘虫中肠液泡型ATP酶(V-ATPase)的H、B和a亚基结合,但是其具体作用机理还尚不清楚。本研究将大肠杆菌(Escherichia coli)中表达得到的东方粘虫中肠V-ATPase A亚基突变体TSCA和V-ATPase B亚基包涵体洗涤、溶解后进行复性,获得可溶性AB亚基复合物后采用亲和层析纯化。将纯化好的AB亚基复合物测定H^+K^+-ATPase活性,证明其有ATP水解活性。随后,测定苦皮藤素V对复合物ATPase的抑制活性,发现加入苦皮藤素后,复合物ATPase活性降低。因此,其可能是通过抑制了AB亚基复合物的ATPase活性,从而产生了杀虫效果,证明AB亚基复合物为苦皮藤素V的潜在靶点之一。这为了解苦皮藤素与VATPase相互作用机制打下了基础,也为进一步开发新型杀虫药物奠定了基础。     

盐和干旱胁迫对燕子掌(Crassula agenten Thunb.)叶片液泡膜H+-ATPase活性的影响

专性CAM植物燕子掌离体叶片的盐胁迫处理和失水干旱处理后 ,液泡膜H ATP酶对低浓度(2 0 0、40 0mmol/L)的盐胁迫 (NaCl胁迫 48h)不敏感 ,而当盐浓度达到 6 0 0mmol/L时 ,ATP水解活性和H 转运活性较对照上升 5 5 %～ 6 5 % ,而干旱胁迫 (4 8h ,失水 12 % )使酶活上升约 30 % ,但是上述各种胁迫均不影响ATP水解与H 转运的耦联比率 ,仍旧维持在12。用Westernblot证实在逆境下 ,H ATP酶的 3种主要亚基A、B、c在膜上的蛋白含量均有所增加 ,且以调节亚基 (B)的变化最为显著     

小鼠单个GV期卵母细胞中ATP8基因的表达分析

目的:探讨小鼠GV期卵母细胞线粒体中ATP8(ATP合酶亚基8)基因的表达情况。方法:应用挤压法从卵巢中分离获得生发泡期(germinal vesicle,GV)卵母细胞;用RT-PCR检测GV期单个卵母细胞中ATP8基因的表达:其中cDNA的合成分两种方法进行:一是将GV期单个卵母细胞直接进行RT合成cDNA,二是先用DNA酶加EcoRⅠ酶祛除mtDNA和核DNA后再进行RT;回收产物构建克隆质粒并测序。结果:1.5%琼脂糖电泳显示、测序结果均表明ATP8基因在GV期卵母细胞中有表达。结论:小鼠GV期卵母细胞特异表达的ATP8基因可能与卵母细胞的正常发育成熟相关。     

用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶CF1各亚基间的相互作用

将菠菜叶绿体ATP合酶CF1的5种亚基基因分别插入到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株,用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体CF1各亚基间的相互作用.结果显示CF1的5种亚基中,γ与ε亚基有较强的相互作用;α与β,α与ε,β与ε,β与δ亚基间也有稳定的相互作用;γ与δ,δ与ε亚基间有微弱的或短暂的相互作用;而α与γ,α与δ,β与γ等亚基间在酵母双杂交系统中没有相互作用.这些结果有助于研究ATP合酶在催化过程中的结构变化和亚基间的相互关系.     

一种小肽的多顺反子串联表达方法

目的：构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,简写为Ecs) 多顺反子串联多拷贝基因。方法：以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒,在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导表达,18% SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。结果：Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%,实现了Ecs的串联表达。结论：Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。     

高活性F1-ATP酶单分子旋转初步观察

从基因突变的F1 ATP酶 (基因突变质粒 ,α C193S ,γ S10 7C ,β亚基带有 10个组氨酸标记 (His Tag) ,转入到菌株大肠杆菌JM10 3)的菌株中筛选出一高表达菌株 .该菌株表达的F1 ATP酶经纯化后其水解活性明显高于文献值 .从单分子水平上进行观察 ,发现在水解ATP过程中 ,γ亚基上连接的荧光标记蛋白微丝 ,其旋转速度要比文献中同样条件下快约一倍     

转铁蛋白在低钾刺激Madin Darby狗肾细胞钠-钾ATP酶中的作用

体外低钾培养肾细胞能刺激细胞膜钠-钾ATP酶。本研究利用Madin Darby狗肾细胞能在无血清培养液中健康生存48h这一特征,研究体外低钾刺激细胞膜钠-钾ATP酶所依赖的血清中的活性因子,观察了表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF1)、前列腺素1(PGE1)和转铁蛋白(tranderrin)在这一过程中的作用。结果表明,在无血清培养液中低钾并不能刺激细胞膜钠—钾ATP酶,而添加转铁蛋白可模拟血清的作用。转铁蛋白能剂量依赖性地增加ouabain结合位点,对细胞膜钠-钾ATP酶作用呈良好的时间效应关系。在低钾无血清培养液中,细胞膜钠-钾ATP酶α1亚基启动子活性增强,α1与β1亚基蛋白质表达的增加依赖于转铁蛋白的存在。进一步研究结果表明,低钾在转铁蛋白的无血清培养液环境中能增加细胞对铁的摄取(^59Fe),该作用可被铁螯合剂(deferoxamine,DFO;35 μmol/L)所阻断。DFO也可阻断转铁蛋白依赖性低钾刺激细胞膜钠-钾ATP酶数目的增多,α1亚基启动子活性增强,α1与β1亚基蛋白质表达增加。以上结果表明,低钾对细胞膜钠-钾ATP酶活性的刺激作用依赖于转铁蛋白所调节的铁的摄取。     

圆红冬孢酵母新颖脂肪酸合酶的重组表达、纯化与活性检测

脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A反应生成脂肪酸,是油脂合成代谢途径中最重要的酶之一。在高产油脂的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides中发现了一种新颖的FAS,它含两个亚基,与其他物种的FAS相比,具有独特的结构域组成,尤其是含两个酰基载体蛋白(ACP)结构域。由于ACP在脂肪酸合成反应中起辅因子作用,推测多个ACP有利于提高FAS的催化活性,为研究该FAS的生物化学和结构特征,构建了表达FAS两个亚基的载体,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),含pET22b-FAS1和pET24-FAS2质粒的重组菌株ZWE06可同时高表达两个亚基,经硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心和阴离子交换层析纯化,得到的重组FAS比活力达到548 mU/mg。纯化的FAS复合物可用于后续酶动力学和蛋白结构研究,且表达与纯化方法的建立对研究其他ACP的功能具有参考价值。