高等植物叶绿体ATP合酶ε亚基的结构与功能

ε亚基是叶绿体ATP合酶最小的一个亚基,有阻塞ATP合酶的质子通道和抑制其水解ATP活力的两种功能。用定点突变和缺失等分子生物学方法对ε亚基的结构功能进行了研究,结果表明：ε亚基42位上的苏氨酸(Thr42)对维持其结构和功能都很重要。与大肠杆菌ATP合酶相比,叶绿体ATP合酶ε亚基C端和N端的氨基酸残基缺失对其结构功能的影响更为敏感。     

蚕豆和玉米叶绿体atpE基因表达产物的生物活性差异及次级结构分析

编码蚕豆和玉米叶绿体ATP合酶ε亚基的atpE基因分别在大肠杆菌中获得了高效表达 ,两种表达的ε亚基蛋白分别与来自蚕豆、玉米和菠菜的缺失ε亚基的CF1重组后 ,发现玉米的ε亚基蛋白在抑制CF1 ATP酶水解ATP、阻塞类囊体膜质子通道以及它促进光合磷酸化等方面均明显地强于蚕豆的ε亚基蛋白。该结果表明 :( 1)ε亚基对ATP合酶活性的调节作用与其同ATP合酶其他亚基间的亲和力大小密切相关 ;( 2 )ε亚基抑制CF1水解ATP和阻塞质子通道两个功能是呈正相关的。圆二色性 (circulardichroism)的分析结果表明 ,玉米CF1ε亚基的 4种二级结构比例为α 螺旋 2 2 .6% ,β 折叠 3 0 .6% ,β 转角 9.3 % ,无规则结构 3 7.7% ;蚕豆CF1ε亚基的 4种二级结构比例为α 螺旋 3 1.4 % ,β 折叠 2 2 .3 % ,β 转角 13 .8% ,无规则结构 3 2 .4 %     

用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶CF1各亚基间的相互作用

将菠菜叶绿体ATP合酶CF1的5种亚基基因分别插入到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株,用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体CF1各亚基间的相互作用.结果显示CF1的5种亚基中,γ与ε亚基有较强的相互作用;α与β,α与ε,β与ε,β与δ亚基间也有稳定的相互作用;γ与δ,δ与ε亚基间有微弱的或短暂的相互作用;而α与γ,α与δ,β与γ等亚基间在酵母双杂交系统中没有相互作用.这些结果有助于研究ATP合酶在催化过程中的结构变化和亚基间的相互关系.     

叶绿体ATP合成酶ε亚基对菠菜叶绿体毫秒延迟发光的影响

在1℃低温条件下,经叶绿体ATP合成酶ε亚基处理的菠菜叶绿体毫秒延迟发光的快相显著高于对照,增加的快相不仅是由膜两侧的电位差所引起的,并且为光系统Ⅱ水氧化释放的质子所促进。当温度升至25℃时,ε亚基对叶绿体毫秒延迟发光快相的影响几乎消失。牛血清白蛋白处理对此快相也有轻微的增强效应。     

蚕豆和玉米叶绿体atpE基因表达产物的生物活性差异 …

编码蚕豆和玉米叶绿体ＡＴＰ合酶ε亚基的ａｔｐＥ基因分别在大肠杆菌中获得了高效表达,两种表达的ε亚基蛋白在抑制ＣＦ１－ＡＴＰ酶水解ＡＴＰ、阻塞类囊体膜质子通道以及它促进光合磷酸化等方面均明显地强于蚕豆的ε亚基蛋白。该结果表明：（１）ε亚基对ＡＴＰ合酶活性的调节作用与基同ＡＴＰ合酶其他亚基间的亲和力大小密切相关;（２）ε亚基抑制ＣＦ１水解ＡＴＰ和阻塞质子通道两个功能是呈正相关的。圆二色性（ｃｉｒｃｕｌ     

酵母线粒体ATP合酶生物合成及组装机制研究进展

线粒体ATP合酶是线粒体氧化磷酸化的关键酶,其功能缺陷会导致能量代谢障碍相关的线粒体疾病。线粒体ATP合酶是由多个亚基组成的蛋白复合物,其生物合成和组装是个复杂的生物过程。酵母是研究线粒体ATP合酶结构、生物合成和组装机制的模式实验材料之一,且相关研究取得了很多进展。本文概述了国内外用酿酒酵母研究线粒体ATP合酶的结构、调控线粒体ATP合酶亚基生物合成和组装的辅助蛋白及合酶的模块化组装过程的研究进展,以期为线粒体ATP合酶的工作机制及相关线粒体疾病的研究提供理论借鉴和参考依据。     

突变的叶绿体ATP合成酶ε亚基对菠菜叶绿体毫秒延迟发光的影响

突变和野生型叶绿体ＡＴＰ 合成酶的ε亚基均可增强叶绿体毫秒延迟发光的快相;不同的突变体对快相的增强强度不同,但与它们对离体ＣＦ１ 的Ｃａ２＋ＡＴＰ酶水解活力的抑制程度情况一致。且这种影响在１ ℃左右的低温下较显著,而温度升至２５ ℃时,这种增强作用趋于消失。加入解联剂后,快相部分消除,ε亚基仍有增强作用。这些结果说明,ε亚基是通过与ＣＦ１ 的专一作用而影响光系统Ⅱ附近类囊体膜的动态结构, 使质子不易从类囊体膜上流失,质子动力势较难被解联剂所去除     

真核DNA聚合酶ε

真核DNA聚合酶ε(DNA polymerase ε, DNAP ε)从1970年发现至今已进行了较为深入的研究,但目前该酶确切功能尚不清楚.该文介绍DNAP ε各个亚基的结构与功能,以及与其相互作用的蛋白质,并介绍DNAP ε可能具有的功能,包括DNAPε在非催化方面的功能.DNAP ε(尤其是最大亚基的C端结构域)可能作为一种“桥梁“或“中继站“,为多种重要蛋白质发挥作用提供一个平台.     

酿酒酵母ATP合酶δ亚基融合蛋白的构建、表达及生物学功能分析

利用分子克隆手段构建了酿酒酵母ATP合酶δ亚基和流感病毒血凝素(haemagglutinin, HA)标签融合蛋白的表达质粒.该融合蛋白在酿酒酵母细胞中能够正常表达,而且能够互补编码δ亚基的ATP16基因缺失株在利用非发酵性碳源方面的表型缺陷,表明该融合蛋白具有野生型δ亚基的功能.同时,构建了在大肠杆菌细胞中表达该δ亚基的ScAtp16p-His6融合蛋白,并用纯化的融合蛋白在家兔中制备了其多抗血清.结果表明此多抗可以很好地与ScAtp16p-His6和HA-ScAtp16p两种融合蛋白特异性结合.这些研究材料的获得为深入研究ATP合酶的解偶联机制和磷酸化调控机理奠定了基础.     

叶绿体atpE基因表达产物的生化特性

在细菌中表达的叶绿体ａｔｐＥ基因产物ε亚基蛋白对不同方式激活的叶绿体ＡＴ－Ｐａｓｅ均有抑制作用,而其抗血清则促进ＡＴ－Ｐａｓｅ活力。Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ε亚基蛋白在光合磷酸化反应中对循环和非循环光合磷酸化都有促进作用,其抗血清对循环光合磷酸化有抑制作用,而对非循环光合磷酸化则起促进作用。     

淡色库蚊ATP合酶B亚基基因克隆和序列分析及其与溴氰菊酯抗性的关系

【目的】克隆淡色库蚊Culex pipiens pallens ATP合酶B亚基基因编码区序列,并进行生物信息学分析,研究其与溴氰菊酯抗性关系。【方法】通过PCR方法扩增ATP合酶B亚基基因编码区序列;利用生物信息学网站在线分析工具,预测ATP合酶B亚基基因编码蛋白的理化性质和功能特征;通过实时定量PCR方法比较ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系和抗性品系中的表达,并在现场种群溴氰菊酯敏感和抗性个体中做进一步验证。【结果】成功克隆淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列(Gen Bank登录号:KY783434),长717 bp,编码238个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白理论相对分子量为26.96 k D,等电点为8.97,在第70-231位氨基酸具有ATP合酶B亚基结构域,未发现信号肽和跨膜区。实时定量PCR结果显示,ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和现场种群溴氰菊酯抗性个体中表达量均上调。【结论】本研究获得了淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列,进行了生物信息学分析,并证实其在溴氰菊酯抗性个体中高表达,为进一步研究该基因在蚊抗药性中的作用奠定了基础。     

ATP合酶的结构与催化机理

ATP合酶 (F1Fo 复合物) 是生物体内进行氧化磷酸化和光合磷酸化的关键酶.随着核磁共振、X射线晶体衍射、遗传学、化学交联等技术在ATP合酶研究中的广泛应用,ATP合酶的整体结构及其各组成亚基结构的研究都有很大的进展.其中细菌ATP合酶结构的研究更为深入.目前对质子通过Fo的转运方式提出两种模型:单通道和双半通道模型.对扭力矩的形成以及旋转催化也有了进一步的认识.Boyer提出的结合改变机理推动了ATP合酶催化机制的研究,现在主要有两点催化机制和三点催化机制.ATP合酶的催化反应受酶的构象变化和外在条件的调节.     

菠菜和蚕豆叶绿体CF_1结构与功能的比较

比较了菠菜和蚕豆叶绿体的光合磷酸化活力以及由不同活化方法活化的叶绿体及可溶CF1的Mg2＋－ATPase和Ca2＋－ATPase的活力,观测到两种叶绿体ATPase的合成和水解ATP的功能有明显差异。从两种叶绿体CF1的SDS－PAGE图谱上可见蚕豆CF1的ε亚基分子量明显小于菠菜的,蚕豆CF1的α和β亚基间分子量的差别也比菠菜的小。     

玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因在E.coli中的表达

玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因（ａｔｐＥ）被克隆到载体ｐＪＬＡ５０５和ｐＷＡ的多聚接头处,形成重组质粒ｐＪＬＡ５０５－ａｔｐＥ和ｐＷＡ－ａｔｐＥ,转化Ｅ．ｃｏｌｉ,并进行温敏诱导表达研究。在大肠杆菌中温敏诱导的基因表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,表达量达全菌蛋白质的３０％以上．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析结果表明温敏诱导的表达产物可特异性地与ε亚基抗体反应,在免疫双扩散中也观察到沉淀线。大肠杆菌表达的玉米叶绿体ａｔｐＥ基因产物以包含体形式存在于细菌中。经对包含体处理后;获得的粗产物可达８０％以上纯度,并具有天然ε亚基蛋白质的生物功能．     

利用酵母双杂交筛选豌豆叶绿体镁离子螯合酶D亚基相互作用蛋白

植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中,形成镁原卟啉IX. 镁离子螯合酶是1个由3个亚基H、D和I组成的多亚基酶,3个亚基均由细胞核编码,进入叶绿体发挥功能.该酶不仅控制着叶绿素的合成,其各个亚基还具有很多其它的功能：H亚基既是ABA受体,又参与叶绿体到细胞核的反向信号传导;D亚基也与叶绿体到细胞核的反向信号传导有关. 本文利用酵母双杂交技术,将编码豌豆镁离子螯合酶D亚基的cDNA片段构建到诱饵载体pGBKT7中,分别用共转化的方法筛选豌豆叶片细胞核编码的均一化cDNA文库和用Mating的方法筛选豌豆叶片叶绿体编码的均一化cDNA文库,共得到121个候选克隆,其中有60个克隆共编码21个叶绿体蛋白质,19个来自于核基因编码,2个来自于叶绿体基因编码. 这些候选蛋白参与叶绿素合成、卡尔文循环、叶绿体蛋白质翻译和叶绿体基因转录等多个代谢过程. 酵母点对点和GST-pull down对其中的4个蛋白做了进一步的验证.这些结果将为D亚基的功能研究提供进一步的线索.     

一种分析叶绿体类囊体膜色素蛋白复合物的蓝绿温和胶电泳系统

采用蓝绿温和胶电泳系统可以非常有效地分离叶绿体蛋白质复合物,包括PSⅠ, PSⅡ, ATP合酶,细胞色素b₆f复合物,捕光色素复合物和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶.还结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将叶绿体多亚基复合物的50多种蛋白质分开,利用免疫印迹对蛋白质复合物进行了初步鉴定,同时还应用蓝色温和胶电泳分析基质、基粒类囊体复合物的组成.     

疏水色谱法制备缺失δ亚基的CF_1(-δ)

PreperationofCF_1DeficientintheδSubunitbyHydrophobicColumnChro－matographyRENHut－Miao，WEIJia－Mian（ShanghaiInstituteofPlantPhysiology,TheChineseAcademyofSciences.Shanghai200032）叶绿体类囊体膜上H－ATPase在光合作用的能量转换过程中起着重要的作用。光合磷酸化就是H”－ATPase利用光合电子传递产生的跨膜电化学质子梯度，把ADP和Pi合成ATP的过程。但是人们对H”－ATPase催化合成ATP的机理、CF；和CF。的连接、各个亚基的功能以及该酶的调节等几个关键性的问题还没有了解得十分清楚。而制备获得缺…     

大肠杆菌多顺反子mRNA上顺反子间序列对基因表达的调节作用

1984年9月在联邦德国举行的第三届欧洲生物能力学讨论会上,McCarthy等报道了大肠杆菌(E·coli)ATP合酶中c亚基的表达受到c亚基基因前顺反子间序列的加强作用。 E.coli ATP合酶是催化氧化磷酸化反应中最后一步反应的酶。它含有8种不同肽链,由同一操纵子编码,原初转录产物是一条多顺反子mRNA,然后分别转译成不同肽链。其中c亚基的特点是具有疏水性,可与氧化磷酸化作用的抑制剂二环巳基碳二亚胺(DCCI)结合。在ATP合酶分子中,c亚基拷贝数是其他亚基的10—15倍。现在证实,c亚基的高效率表     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB完整基因(GenBank登录号为DQ067451)在内的一段序列,测序与序列分析表明:该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

ATP合酶旋转催化的一种新机制

ATP合酶利用跨膜离子(主要是质子)梯度提供的能量,催化由ADP和Pi(磷酸)合成ATP的反应.已有证据表明,这种催化反应通过ATP合酶内部亚基之间的相对旋转而实现.然而,现有的基于整合在细胞膜内的c环及附着于其上的中心杆(由?和?亚基组成)转动的ATP合酶旋转模型存在多方面的理论缺陷,也与某些实验数据不符.本文提出了一种新的ATP合酶旋转催化模型,其中发生旋转的是?3?3六聚体.具体而言,质子的跨膜转运引起c环的周期性构象改变,从而使得附着在c环上的中心杆产生往复运动,这种往复运动驱动?3?3六聚体的连续转动.这种工作模式与按压式伸缩圆珠笔中推杆的往复运动驱动凸轮产生连续转动的工作机理十分相似.新模型不仅避免了现有模型的理论缺陷,而且更好地解释了已有实验数据.