siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,所合成的 5条T7siRNAs ,均能特异性地抑制萤光素酶基因的表达 ,抑制率分别为 94 31%、80 0 1%、78 0 1%、80 33%、85 6 4% ,其中以靶向HCVIRES第二茎环结构的T7siRNA1抑制率最高 ,且对HCV基因的抑制作用有剂量依赖性 ,随T7siRNA1量的增加 ,抑制率逐渐增强 .siRNA抑制HCV基因的作用具有良好的特异性 ,改变其中 1个核苷酸即无显著抑制作用 .     

HCVIRES介导萤火虫荧光素酶翻译的双顺反子载体的构建与在小鼠体内的表达

将HCVIRES插入双报告基因海肾荧光素酶 (Rluc)基因和萤火虫荧光素酶 (Fluc)基因之间 ,建立了“依赖帽子的扫描机制”翻译表达Rluc ,HCVIRES调控Fluc翻译的双顺反子表达载体pCI Rluc HCVIRES Fluc ,通过酶切反应及转染HepG2细胞鉴定双荧光素酶瞬间表达活性等试验 ,证实获得了表达双荧光素酶的双顺反子载体 .并应用水压转染法将双顺反子表达质粒导入小鼠体内 ,在小鼠肝脏检测到高水平表达的Rluc和Fluc .该研究成功构建一种HCVIRES介导萤火虫荧光素酶基因表达的双顺反子载体 ,并在HepG2细胞及小鼠体内进行了瞬时表达 ,为进一步建立稳定评价靶向HCVIRES药物作用的细胞及小动物模型研究奠定了基础