RNA编辑蛋白OTP82的表达与纯化

摘要 目的：利用原核系统表达RNA编辑蛋白OTP82,通过蛋白变复性的方法得到全长蛋白,并优化实验条件提高OTP82的收率。方法：利用原核表达系统表达OTP82全长融合蛋白（HSO）,表达后的菌体用高压细胞破碎仪匀浆后收集包涵体并用包涵体洗涤液重复洗涤两遍,然后用含有8 M尿素的变性缓冲液将包涵体搅拌溶解得到蛋白原始液。将蛋白原始液复性后采用镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot检测等方法对HSO的变复性结果进行筛选。结果：通过对复性缓冲液中盐浓度、谷胱甘肽的浓度和比例以及小分子添加剂的探索,得到了OTP82融合蛋白适合的变复性条件（pH 8.5 100 mM Tris,400 mM NaCl,200 mM 精氨酸,5 mM GSH,0.5 mM GSSG,6 mM β-环糊精,2 mM EDTA,1 mM PMSF）复性率达到2.73%（获得蛋白0.42 mg/L）。结论：通过变复性的方式能够在体外得到OTP82的粗蛋白,为揭示RNA编辑蛋白作用机制提供基础实验依据,为后续利用PPR蛋白进行工程蛋白设计奠定了基础。     

融合牛肠激酶轻链EKL包涵体蛋白的复性纯

大肠杆菌高密度发酵表达肠激酶轻链融合蛋白DsbA-rEK_L,主要以包涵体形式存在。包涵体经4mol/L尿素和 0.5% Triton X100洗涤,以6mol/L盐酸胍、100mmol/L DTT溶解,在胱氨酸存在下,以脉冲加样方式复性。融合蛋白复性在6mmol/L胱氨酸存在下、脉冲加量0.03mg/mL和复性终蛋白浓度0.3mg/mL为最佳复性方案。 复性的融合蛋白加2mmol/L CaCL2后快速自切。经IDASepharose及Qsepharose 纯化,rEKL纯度可达95%以上,可高效酶切重组瑞特普酶融合蛋白Trx-rPA。实现了大规模生产rEK_L,每升发酵液经复性及纯化后,可得rEK_L 60mg/L以上,使以融合蛋白表达rPA等药用蛋白成为现实。     

蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展

外源基因在大肠杆菌中表达后常形成不溶性的无活性包涵体。包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍。然而,在合适的条件下,包涵体经过溶解、纯化、复性过程后可在体外重新折叠成有活性的蛋白质。迄今,已对蝰科、眼镜蛇科11种毒蛇的18个基因(包括金属蛋白酶、PLA₂、β-银环蛇毒素、心脏素素、丝氨酸蛋白酶、神经生长因子、C-型凝集素等)成功进行了原核表达,采用稀释复性、透析复性和层析复性三种方法成功进行了包涵体复性。着重就蛇毒蛋白原核表达后包涵体复性所用的方法予以综述。     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A₂（A.aBPLA₂）基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达.表达产物A.aBPLA₂约占细菌蛋白质总量的20％,并以包涵体的形式存在.纯化包涵体后,将产物变性、复性,然后用FPLC Superose^TM12纯化,产物经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带.对纯化后的表达A.aBPLA₂进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定.结果显示,表达A.aBPLA₂的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A₂酶活性相近,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A₂的溶血活性,没有抑制血小板聚集活性.最后对磷脂酶A₂的结构与这些活性的关系进行了讨论.     

重组人载脂蛋白AI米兰变体在大肠杆菌中的高效表达

通过大肠杆菌表达系统来生产重组人载脂蛋白AIM(proapolipoprote in AIM,proapoAIM)。整个proapo AIM基因被分成两个片断,通过RT-PCR的方法合成。在对该基因的上游部分进行改造后,插入到表达载体pBV220中进行表达。蛋白的表达量达到45%左右,蛋白的表达形式为包涵体。包涵体通过疏水柱进行柱上复性,复性后的蛋白具有良好的生物活性。     

重组羧肽酶原B的复性方法研究*

构建的羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中获得高表达。但目的蛋白是以包涵体的形式存在。为了获得活性羧肽酶B,必须对其包涵体进行变复性。首先利用稀释复性确定了羧肽酶原B复性的最佳缓冲液;在凝胶过滤复性中,研究了柱长和洗脱流速对羧肽酶原B复性效率的影响;另外对比了稀释复性、透析复性、凝胶层析复性和Ni²⁺亲合层析法等四种方法对羧肽酶原B的复性效果。结果发现,这4种方法的复性效果有以下顺序:凝胶过滤复性>稀释复性>Ni²⁺亲合层析>透析复性。     

抗SARS 人源单链抗体H12的表达及复性

从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARS-CoV人源单链抗体H12,亟待鉴定。为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28a-H12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上。采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性与纯化,结果显示两种方法都能使得单链抗体复性。与稀释复性法相比,柱复性效果更好,其抗原结合活性是稀释复性法的1.51倍。柱复性后的单链抗体亲和力测定的解离常数K_d为73.5nmol/mL。为进一步研究单链抗体H12的功能奠定了基础。     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β₂-微球蛋白(β₂m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分, 为制备MHC-Ⅰ类分子四聚体的必要成分。 根据已报道的序列设计特异引物, 利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β₂m基因, 并构建了成熟β₂m的原核表达载体, 在大肠杆菌中得到高效表达。 表达的β₂m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β₂m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β₂m抗体反应的特性。此工作为制备MHC-Ⅰ类分子四聚体奠定基础。     

抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定

采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出V_H和V_L可变区基因,再通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD19单链抗体（抗CD19-ScFv）基因。将其克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,抗CD19-ScFv在BL21（DE3）菌中获得表达,重组蛋白的相对分子量为27kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实抗CD19ScFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD19结合,保留了鼠源性单抗与CD19结合活性。抗人CD19-ScFv的构建与表达,为下一步针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。     

蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

目的:应用大肠杆菌表达系统表达纤溶性蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase。方法:运用PCR技术扩增人工合成的目的基因,引入Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切位点;目的基因经Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后,克隆到pET22b载体上,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内表达,对获得的包涵体进行体外透析复性;应用纤维蛋白原水解法、纤维蛋白平板法和纤维蛋白层叠法检测复性后蛋白的降纤活性。结果:目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中获得高表达,复性后的蛋白具有降解纤维蛋白(原)的活性。结论:Alfimeprase包涵体可以通过复性获得活性产物。     

乙型肝炎病毒pre-S1区中和抗体可变区的原核表达

鼠源单克隆抗体MA18/7是特异识别乙型肝炎病毒 (HBV)pre S1抗原的中和抗体。为表达MA18/7的小分子抗体 ,将MA18/7的重链可变区基因(V_H)和轻链可变区(V_L)基因分别克隆到原核表达载体pTO-T7进行原核表达。结果V_H和V_L均以包涵体的形式高效表达 ,包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度>90%的重组抗体片段。生物传感器、竞争ELISA和间接ELISA测定均显示 ,V_H 或V_L 均不能结合相应抗原 ,但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体Fv,表明MA18/7的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组成.     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

精氨酸代谢调控蛋白ArgR调控嗜热链球菌胞外多糖合成

[目的] 研究精氨酸代谢调控蛋白ArgR对嗜热链球菌胞外多糖（EPS）合成的调控作用。[方法] 利用大肠杆菌异源表达嗜热链球菌ArgR蛋白,通过尿素变性-复性和Ni²⁺亲和层析纯化。采用凝胶电泳迁移（EMSA）和生物膜层干涉（BLI）分析ArgR和eps基因簇中P_epsA启动子的相互作用和动力学信息。构建过表达和弱化argR基因菌株,利用苯酚-硫酸法测定其合成EPS差异。[结果] 大肠杆菌异源表达的ArgR为包涵体,使用尿素变性-复性纯化可获得2.95 mg/mL可溶性蛋白;EMSA和BLI结果显示ArgR和启动子P_epsA有特异性结合,且结合因解离水平低而稳定;过表达argR基因可显著降低嗜热链球菌EPS合成,而弱化argR基因则提高EPS合成。[结论] 本研究表明ArgR能特异性结合嗜热链球菌eps基因簇启动子,并负调控EPS生物合成。     

重组人表皮生长因子包涵体的表达、纯化及复性

目的:通过优化人表皮生长因子(hEGF)基因序列,利用大肠杆菌大量表达重组hEGF(rhEGF)包涵体,经过包涵体纯化复性获得高活性的rhEGF。方法:采用全基因合成优化后的序列,克隆至pET-30a表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,将rhEGF包涵体用尿素溶解后过Ni柱纯化并稀释复性,根据药典对得到的rhEGF进行纯度及活性测定。结果:构建了rhEGF的表达载体pET-30a-rhEGF,表达出的蛋白主要存在于包涵体中,相对分子质量为6.5×10~3,包涵体经过纯化复性后获得的rhEGF纯度可达92.8%,生物活性约4.94×10~7IU/mg。结论:得到了具有较高活性的rhEGF。     

人EGF受体L2结构域在大肠杆菌中表达、包涵体柱上复性及纯化

以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR-L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni²⁺-NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR-L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95％,复性的EGFR-L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni²⁺-NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。     

香菇C91-3转录本Unigene 24277基因克隆表达及其生物学活性的研究

通过对香菇C_91-3转录本Unigene 24277基因的生物信息学分析,克隆表达含RCC1结构域的Unigene 24277基因,并研究其抗肿瘤活性。从香菇C_91-3菌丝体中提取总RNA,反转录合成cDNA,并利用Rapid Amplification of cDNA Ends（RACE）技术获得基因全长。NCBI数据库分析提示其含有RCC1结构域。PCR扩增RCC1结构域,将其克隆产物与pET-32a（+）载体连接,热转化至E.coil Rosetta-gami（DE3）中诱导表达,纯化、复性后,通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果显示原核表达载体构建成功,重组蛋白成功诱导表达,并初步证明了重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖活性的功能,为后续抗肿瘤机制的探究奠定了基础。     

抗人VEGF受体Ⅱ基因Ⅲ区单链抗体基因的构建和表达

采用RT-PCR技术从分泌抗人血管内皮生长因子受体Ⅱ（kinase insert domaincontaining receptor,KDR）基因Ⅲ区单克隆抗体Ycom1D3的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L基因之间引入柔性短肽（Gly₄Ser）₃,体外构建Ycom1D3单链抗体基因Ycom1D3-ScFv）,将其克隆至pAYZ表达载体,在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,Ycom1D3-ScFv在E.coli 16C9中获得表达,重组蛋白的相对分子量为30kD,与预期结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,TALON 金属亲合层析基质（TALON metal affinity resin）纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实该单链抗体可与人脐静脉内皮细胞结合,保留了鼠源单抗与KDR抗原的特异性结合活性。抗KDRⅢ单链抗体基因Ycom1D3-ScFv的成功构建和功能性表达为靶向诊断治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

包涵体复性研究进展(英文)

用基因工程技术在大肠杆菌高水平表达重组蛋白时,通常形成无生物活性的包涵体。包涵体在体外经分离、溶解与重折叠后可实现复性,表现为具有生物活性的蛋白。总结了包涵体的相关复性技术,重点介绍重折叠的最新进展情况 。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定

旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建s FcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠s FcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠s FcγRIIb基因,构建原核表达载体s FcγRIIb-p ET17b,转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对s FcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白s FcγRIIb可被特异性抗体所识别且与Ig G具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白。