噬菌体裂解酶研究进展

噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体所特有的细胞壁水解酶。研究表明,所有噬菌体裂解酶在结构上具有相似性,即含有2个结构域：比较保守的N端催化区和差异较大的C端特异性结合区。裂解酶的高亲和性与种属特异的细胞壁糖基有关,而后常常是细菌存活的必要成分。所以,细菌难以产生对裂解酶的抗性。本简要综述噬茵体裂解酶的研究进展。     

应用基因组工程构建新型大肠杆菌细胞工厂

基因组工程（genome engineering）是指为了实现某一目标对复制系统进行有意地、广泛地遗传修饰。大肠杆菌作为常用细胞工厂之一,在生物制造领域应用广泛,已成为合成生物学的主要研究对象。应用基因组工程改造大肠杆菌可以进一步拓展其应用范围。介绍了基因组工程最新技术发展,如基因组整合、染色体进化、多元自动化基因组工程、可寻迹多元重组工程等,及其在改造大肠杆菌提高其生产能力、稳定性及环境耐受能力等方面的研究进展。     

抗噬菌体工程菌的筛选

噬菌体污染常引起溶菌,造成人力物力浪费。应用自发突变的原理成功地从溶菌液中筛选到抗噬菌体的工程菌株;在发酵罐中培养,该菌株生长行为和表达水平没有变化。     

人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因,克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。     

胸腺肽α1-Spl DnaX内含肽融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肽α1(Tα1)与Spl DnaX内含肽融合蛋白AS的体外切割动力学。方法:构建Tα1和SplDnaX内含肽的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肽介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响。结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肽介导的切割率逐渐增大;最终采用300 mmol/Lβ-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%。结论:通过对Spl DnaX内含肽的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tα1和其他小分子多肽提供了技术基础。     

人肝细胞生长因子(hdHGF)基因在毕赤酵母中的分泌表达

研究了hdHGF基因在毕赤酵母中的表达 .以人胎盘mRNA为模板 ,经逆转录、重叠PCR获得hdHGF全长和成熟基因片段 .将该基因片段克隆到pPIC9载体上 ,将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115,筛选mut+ 表型 ,经甲醇诱导可实现rhdHGF的分泌表达 .经摇瓶培养筛选出 4株表达水平较高的酵母工程菌株 ,SDS PAGE分析和Western印迹试验表明 ,产物分子量约为80kD ,5L发酵罐高密度培养已使生物量达 13 5g L(干重 ) ,发酵液上清总蛋白量为 8 0g L ,电泳结果表明rhdHGF表达水平为总蛋白的 12 3 % .     

应用实验设计优化制备适于口服的聚酯微球

采用双乳溶剂蒸发法制备包裹蛋白质的聚酯微球 ,蛋白质包裹率大于 80 %。应用均匀设计和正交设计试验研究了 8种因素对微球粒径的影响。结果表明 ,粒径主要受有机相中聚合物浓度和外水相中稳定剂浓度的影响。通过二次回归组合设计 ,建立了微球平均粒径与聚合物浓度及稳定剂浓度之间的数学关系式。根据此式 ,选择不同的聚合物浓度和稳定剂浓度可制备适于蛋白质口服给药的微球。     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2在含乳酸培养基中的高表达

确定了工程菌MM2中霍乱毒素B亚单位(CTB)在含乳酸培养基中的高表达方案。采用两阶段控制培养温度(30℃→37℃)可提高CTB产量4倍,提高后期pH值(72→84)可提高CTB比表达水平214倍,中间补加乙酸钠可提高CTB产量65%。在5L发酵罐培养菌密度OD₆₀₀达30,CTB产量达1867mg/L,产物在培养液中以多聚体形式存在,具有抗原性。     

rimJ基因缺失不影响大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性

目的:研究rimJ基因对大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性的影响。方法:利用SceⅠ-Red同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的rimJ基因缺失,得到rimJ缺失突变菌;比较缺失突变株和原始菌株在不同温度(25℃、37℃、42℃)下的最大比生长速率,利用统计学方法分析rimJ基因的缺失对BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性是否有影响。结果:rimJ基因被成功敲除;统计分析结果表明缺失突变株和原始菌株的最大比生长速率没有明显区别。结论:rimJ基因缺失对大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性无影响。