SAM-V核糖开关RNA体外转录体系优化

为了提高RNA体外转录效率,选取SAM-V核糖开关晶体结构模板对RNA体外转录体系进行优化。结果表明:目的RNA相对百分含量在反应时间和Mg2+添加浓度分别为8h和85m M/L时达到最高值,优化体系较标准体系目的RNA相对百分含量提高了一倍。我们的工作为下一步准备SAMV核糖开关晶体打下了基础。     

人源CBX7功能结构域的重组表达与纯化

CBX7(chromobox 7)在细胞寿命延长和癌症发生中起着重要的调控作用。然而,获取足量的全长CBX7蛋白并用于结构研究极为艰难。实验阐述了CBX7功能结构域CBX7(aa 145～227)重组表达载体构建的详细过程。同时,通过Ni-NTA亲和层析对融合目的蛋白进行了纯化,并利用SDS-PAGE及Western-blot进行了鉴定分析。纯化后的融合蛋白样品通过离子交换和分子筛层析进一步分离剩余杂质。本实验得到的高浓度CBX7蛋白可用于结晶,为后续CBX7的结构和功能研究奠定了基础。     

人体鼠双微体2 C端结构域ZF&RING 重组蛋白的表达、纯化及单体结构研究

目的:通过在大肠杆菌SUMO系统中对鼠双微体2(MDM2)C端结构域ZFRING(aa.300-491)进行构建并进行表达,酶切和纯化,从而得到MDM2蛋白C端结构域的单体结构,为其后续的晶体研究及MDM2非p53依赖途径的研究提供途径。方法:利用大肠杆菌SUMO表达系统对zfring基因进行重组构建。构建成功的表达载体经诱导表达优化后,通过Ni-NTA进行亲和层析纯化,并利用SDS-PAGE及Western blot鉴定分析。纯化后的融合蛋白经ULP1酶切得到目的蛋白ZFRING,并通过Hi Trap Q FF离子交换层析检验和去除杂质DNA。最后通过分子筛检验其蛋白结构。结果:构建了SUMO-ZFRING重组载体。重组载体在大肠杆菌高效可溶性表达,纯化并酶切后的目的蛋白ZFRING以单体形式存在。结论:通过原核表达、纯化、酶切及层析发鉴定,成功获得高稳定、高纯度且为单体结构的MDM2 C端结构域ZFRING蛋白,为后续关于MDM2,尤其是其非p53依赖途径的结构学和功能学提供了思路和途径。     

噬菌体phi29末端酶gp16蛋白C端结构域在溶液中的构象分析

噬菌体phi29是一种双链DNA病毒,它的增殖和成熟过程需要将较大的子代DNA包装入一个空间极其有限的新生病毒衣壳中,这一步骤由其转运马达完成.转运马达具有三个部分:头颈连接器蛋白(the connector)、pRNA和ATP水解酶蛋白(gp16).在结构预测中发现gp16蛋白的C端结构域可能与pRNA或DNA结合,但尚未有相关文献可以证明这种相互作用,因此其结构的解析成为研究其功能的关键.本文利用大肠杆菌SUMO表达系统,对噬菌体phi29 gp16蛋白的C端结构域进行重组构建并诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析纯化,再用分子排阻色谱获得高纯度的目的蛋白质单体,纯度达到95%左右.最后用X射线小角散射技术(small angle X-ray scattering)对其构象进行分析,收集小角散射数据,当目的蛋白的浓度为1.3 g/L、所得到的目的蛋白的三维结构与同源蛋白FtsK的晶体结构高度拟合,且通过CRYSOL软件反推计算的曲线与实验曲线高度重合.通过原核表达、纯化及结构分析,成功获得了该结构域在溶液中的状态信息.这一研究不仅为后续关于该结构域的功能研究奠定基础,也为病毒感染的诊断和治疗提供新思路.     

RNA编辑蛋白OTP82的表达与纯化

摘要 目的：利用原核系统表达RNA编辑蛋白OTP82,通过蛋白变复性的方法得到全长蛋白,并优化实验条件提高OTP82的收率。方法：利用原核表达系统表达OTP82全长融合蛋白（HSO）,表达后的菌体用高压细胞破碎仪匀浆后收集包涵体并用包涵体洗涤液重复洗涤两遍,然后用含有8 M尿素的变性缓冲液将包涵体搅拌溶解得到蛋白原始液。将蛋白原始液复性后采用镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot检测等方法对HSO的变复性结果进行筛选。结果：通过对复性缓冲液中盐浓度、谷胱甘肽的浓度和比例以及小分子添加剂的探索,得到了OTP82融合蛋白适合的变复性条件（pH 8.5 100 mM Tris,400 mM NaCl,200 mM 精氨酸,5 mM GSH,0.5 mM GSSG,6 mM β-环糊精,2 mM EDTA,1 mM PMSF）复性率达到2.73%（获得蛋白0.42 mg/L）。结论：通过变复性的方式能够在体外得到OTP82的粗蛋白,为揭示RNA编辑蛋白作用机制提供基础实验依据,为后续利用PPR蛋白进行工程蛋白设计奠定了基础。