注射用重组人干扰素βser17的分离纯化及鉴定

重组人干扰素βser17(rhIFN βser17)工程菌经发酵培养后,采用高压匀浆破菌、离心分离包涵体、有机抽提、酸沉淀、SephacrylS -200、SephadexG -75等进行分离纯化,通过各种方法对终产品进行鉴定。结果显示,纯化的rhIFN- βser17比活性超过 2×107IU/mg,纯度超过 99%,其它各项质量指标均符合质量标准。通过研究建立了大规模制备rhIFN- βser17的纯化工艺,研制出了符合规程要求的注射用rhIFN -βser17纯品,为临床研究奠定了基础。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

重组人干扰素—β的中试研究

从大肠杆菌中大规模纯化新型干扰素β(IFN-βser17).首先建立IFN-βser17发酵和纯化工艺,连续大量纯化三批,并对纯化终产品进行全面鉴定.建立了稳定的发酵和纯化工艺流程,中试三批菌产量平均为4.33g/L,IFNβser17的表达量平均为20%,经破碎、粗提、精制后IFN-βser17的比活达2×107IU/mg以上,纯度超过96%,其他检定项目也均符合规程要求.     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

发酵条件对毕赤酵母表达重组人干扰素ω糖基化的影响

发酵条件是影响毕赤酵母 (P .pastoris)表达外源重组糖蛋白时糖基化的重要因素。通过菌体浓度、起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、装液量等摇瓶发酵实验 ,研究不同发酵条件对毕赤酵母表达分泌型重组人干扰素ω(rhIFNω)过程中糖基化的影响 ;同时 ,在连续培养过程中考察pH值变化对rhIFNω糖基化的影响和分批发酵过程中rhIFNω糖基化的变化。结果表明 ,控制菌体密度 250g L(WCW)、起始pH值 6 0、装液量小于 30mL、甲醇诱导浓度 15g L、甲醇诱导 3次 (每 24h诱导一次 )等发酵条件 ,有利于摇瓶发酵过程中rhIFNω的糖基化 ;控制pH值 70～75可促进rhIFNω的糖基化 ;分批发酵过程中 ,糖基化与非糖基化rhIFNω的含量有同比变化趋势 ,但糖基化rhIFNω所占比例明显低于摇瓶发酵实验的结果 ,其原因有待进一步研究。     

重组人干扰素ω在对数生长期毕赤酵母中的高效表达特性研究

用不同比生长速率μ的毕赤酵母探讨其表达外源重组蛋白的差异性,通过起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、菌体浓度、装液量等实验,优化具有较高μ的对数生长期毕赤酵母表达rhIFNω的摇瓶条件。结果表明,μ对毕赤酵母表达rhIFNω有显著影响。μ为0.1612h-1的毕赤酵母表达rhIFNω最高为558mg/L,较μ为0.1321、0.0505和0.0052h-1的毕赤酵母分别提高50%、68%和99%。对数生长期的毕赤酵母表达rhIFNω的最适摇瓶表达条件为:250mL摇瓶装入30mL BMMY,控制菌体浓度达到200~300g/L(WCW),起始pH值自然,每24h添加甲醇15g/L一次,诱导表达周期为4d。通过表达条件的优化,rhIFNω的表达量达到1070mg/L,较优化前提高149%。     

乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpN Ecc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5% 的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L（WCW）,可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

弧菌外膜蛋白ompk工程菌规模化培养表达初探

目的:为Ompk亚单位疫苗生产提供参数。方法:利用振荡和发酵培养,测定不同培养时间的菌液浊度和蛋白诱导表达效果。结果:工程菌30℃摇瓶培养10h,种子罐培养8～10h,较为合适;摇瓶和5L发酵罐诱导表达培养,升温42℃诱导表达,7h效果较佳;经5批次50L、500L发酵罐诱导表达培养,均可得到重组蛋白表达的工程菌体,50L和500L发酵罐最高生物量分别为5.32g/L和6.38g/L,平均可达到3.75 g/L和4.74 g/L;适当延迟升温诱导前的培养时间,可提高工程菌的得率。结论:初步确定了重组蛋白工程菌规模化诱导表达培养方法,利用500L发酵罐培养可得到诱导表达的工程菌体。     

大肠杆菌发酵生产重组人源抗-HBs Fab

在KLF2000发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD/HBs Fab的TOP10大肠杆菌,生产人源抗-HBs Fab,为批量生产作准备,在发酵过程中,控制溶氧30%以上,温度37℃,在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到9h,加入阿拉伯糖,至终浓度为0.02%,30℃诱导表达5h,收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western blot方法检测Fab抗原性,Dot blot方法检测生物学活性。14h发酵结束后,菌体密度最终达96g/L,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的6%,含量为80mg/L,以重组质粒pBAD/HBs Fab,大肠杆菌TOP10表达表达比率与摇瓶相比没有降低,表达量达80mg/L左右,为大批量生产作了准备。     

生长速度对β干扰素工程菌稳定性和产物表达的影响研究

为了研究发酵培养阶段生长速度对重组人干扰素β(hIFN-β)工程菌稳定性、菌体密度和干扰素表达的影响,采用日本LE．Marubishi MSJ-50L发酵罐,在发酵过程中于诱导后通过控制不同的补料速度,检测低和高生长速度及发酵结束后菌体密度、稳定性和重组人干扰素β的表达量。诱导后维持低生长速度,发酵结束后平均密度A600值为7．52,表达量达20．7％,质粒稳定率好,达到91％,粗制干扰素收获2．37克;维持高生长速度,发酵结束后平均密度A600值达20．57,而表达量降为4．13％,质粒稳定率降为27％,粗制干扰素收获仅为0．59克。诱导后生长速度对工程菌稳定性和产物表达有明显影响。     

大肠杆菌发酵生产重组人源抗

在KLF2000发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD/HBs Fab的TOP10大肠杆菌,生产人源抗HBs Fab,为批量生产作准备。在发酵过程中,控制溶氧30%以上,温度37℃,在基础培养基内生长4 h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到9 h,加入阿拉伯糖,至终浓度为002%,30℃诱导表达5h,收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western blot方法检测Fab抗原性,Dot blot方法检测生物学活性。14h发酵结束后,菌体密度最终达96g/L,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的6%,含量为80mg/L。以重组质粒pBAD/HBs Fab,大肠杆菌TOP10表达生产的人源抗HBs Fab为可溶性具生物学活性的蛋白,与包涵体表达相比避免了变性、复性这一复杂过程,发酵罐表达比率与摇瓶相比没有降低,表达量达80mg/L左右,为大批量生产作了准备。     

重组毕赤酵母高密度发酵表达H5N1禽流感病毒糖蛋白

在10L发酵罐中,对高致病性禽流感病毒H5N1糖蛋白HA1在重组毕赤酵母中的表达发酵工艺进行了研究。通过分批补料培养方法探讨不同培养温度、诱导温度、补料方式、微量元素等因素对菌体的生长以及重组蛋白表达和活性的影响。结果表明,菌种培养和诱导温度均为25oC时,菌体的生长、分泌表达量和与广谱中和抗体的反应活性较好;微量元素是影响重组HA1蛋白生物活性的重要因素;通过优化高密度发酵工艺,H5N1病毒糖蛋白HA1在发酵罐中的表达量比摇瓶培养提高10.5倍,达到约120mg/L,为大规模制备高致病性禽流感病毒的HA1蛋白奠定了基础。     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

重组尿酸氧化酶发酵工艺优化

目的:优化并获得重组尿酸氧化酶(rUOX)基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-32a-uox高密度发酵的工艺参数。方法:在三角摇瓶中进行培养条件的优化实验,分别考察了pH值、接种量、无机盐、碳源、诱导强度等对工程菌生长和重组蛋白表达的影响,得到了优化的发酵条件;在此基础上放大至NBS BIOFLO 110 14 L发酵罐,通过对诱导时机的优化,利用分批补料发酵的方式,使rUOX在高密度培养的条件下得到高表达。结果:在优化的发酵条件下,菌体密度(D600nm)最终达到50以上,相当于20 g/L干重;可溶性rUOX占菌体总蛋白量的45%,其含量达到3.45 g/L。结论:为规模化制备重组黄曲霉尿酸氧化酶奠定了基础。     

提高重组TRAIL表达产率的优化策略

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Apo2L/TRAIL）是一种新型的抗肿瘤蛋白。针对缩短发酵周期,提高生产效率这一目标,首先在摇瓶中利用响应面设计优化发酵表达条件,总TRAIL蛋白的表达量提高到25.7%。在此基础上研究了发酵条件对可溶性TRAIL蛋白表达量的影响。于3.7L发酵罐放大进行补料-分批发酵实验时,单位菌体可溶性TRAIL蛋白的表达量提高了67%,实现了在大肠杆菌高密度培养过程中单位细胞重组TRAIL蛋白的可溶性表达和体积生产率的提高。     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。