应用H1-U6双启动子RNAi载体筛选人泛素结合酶hUBE2W的RNAi有效靶点

hUBE2W是新近鉴定出的一种Ⅰ型泛素结合酶,可能在肿瘤发生和DNA损伤修复过程中起重要作用.RNA干涉是指通过形成局部双链RNA进而特异性地降解细胞内同源基因mRNA的机制,目前已成为基因功能研究的有力工具.通过构建H1-U6双启动子RNAi载体,可以在体内直接转录出针对hUbe2w基因的两段互补小RNA,更接近于生理状态下小干涉RNA的作用.利用RT-PCR方法从293FT细胞总RNA中扩增出hUbe2w基因,分别将其连接至质粒pGL3-Control,pCMV-myc和pDsRed-express-C1中,以便在mRNA水平和蛋白水平检测RNA干涉效果.RNA干涉载体分别与上述报告载体共转染293FT细胞,测定萤光素酶活性和hUBE2W蛋白表达水平,结果显示靶点125和259能够在mRNA水平和蛋白质水平显著降低hUbe2w的表达.     

RNA干扰技术及其应用

RNA干扰（RNAi)是利用具有同源性的双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默的现象。它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术,从利用体外合成双链RNA到通过质粒稳定表达小型干扰RNA诱发RNA干扰现象,这项技术被不断完善,并被广泛的应用,尽管RNAi的作用机制仍不清楚,但实验证实在RNA干扰过程中,外源的双链RNA在体内会被切割成小片段,新的双链RNA被合成,从而RNAi的作用机制假说正被逐步修正,由于RNAi技术的高效性和特异性,它已经成为基因功能研究的一种新方法。     

针对leader序列的siRNA能够有效抑制SARS冠状病毒多个mRNA的表达

小干扰RNAs(siRNAs)能够有效降解具有互补序列的RNA.在SARS-CoV的基因组RNA和所有亚基因组RNA的5′端均有一段共同的leader序列,而且该leader序列在不同的病毒分离物中高度保守,因此leader序列可作为一个用于抑制SARS-CoV复制的有效靶点.研究表明,针对leader序列化学合成的siRNA和DNA载体表达的shRNA都可以有效抑制SARS-CoV mRNA的表达.Leader序列特异的siRNA或shRNA不仅可以有效抑制leader与报告基因EGFP融合基因的表达,而且还可以有效抑制leader与刺突蛋白(spikeprotein)、膜蛋白(membrane protein)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)基因的融合转录产物的表达.结果表明,针对leader序列的RNA干扰可以发展成为一种抗SARS-CoV治疗的有效策略.     

RNA干扰研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默现象,广泛存在于真菌、植物和动物中。它是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。细胞内双链RNA在酶的作用下,形成20-25碱基大小的小干扰RNA(siRNAs),由siRNAs进一步掺入多组分核酸酶并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,抑制该基因在细胞内的翻译表达。RNAi技术是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因沉默技术。与反义寡核苷酸等传统方法相比,RNAi技术有着无可比拟的优势。本文就其近年的研究进展作一综述。     

针对SARS冠状病毒重要蛋白的siRNA设计(英)

RNA干涉(RNA interference, RNAi)是一种特异性地导致转录后基因沉默的现象,在哺乳动物细胞中小分子干扰RNA双链体(small interfering RNA duplexes, siRNA duplexes)可以有效地诱导RNAi现象,为一些疾病的治疗开辟了新的途径.针对SARS冠状病毒(SARS coronavirus, SARS-CoV)中编码5个主要蛋白质的基因,用生物信息学的方法设计了348条候选siRNA靶标.在理论上,相应的siRNA双链体能特异地抑制SARS-CoV靶基因的表达,同时不会影响人体细胞基因的正常表达,这为进一步siRNA类药物的实验研究提供了理论基础.     

针对SARS冠状病毒重要蛋白的siRNA设计(英文)

NA干涉 (RNAinterference ,RNAi)是一种特异性地导致转录后基因沉默的现象 ,在哺乳动物细胞中小分子干扰RNA双链体 (smallinterferingRNAduplexes ,siRNAduplexes)可以有效地诱导RNAi现象 ,为一些疾病的治疗开辟了新的途径 .针对SARS冠状病毒 (SARScoronavirus ,SARS CoV)中编码 5个主要蛋白质的基因 ,用生物信息学的方法设计了3 48条候选siRNA靶标 .在理论上 ,相应的siRNA双链体能特异地抑制SARS CoV靶基因的表达 ,同时不会影响人体细胞基因的正常表达 ,这为进一步siRNA类药物的实验研究提供了理论基础     

靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）RNAi载体的构建及活性评价

RNA干涉是由与特定基因同源互补的双链RNA,在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程.为研究内源性的siRNA对靶基因的抑制效果,用pPUR/U6载体构建用于细胞内转录靶向hTERT基因的短发夹状siRNA表达质粒,并评价其对hTERT基因的抑制效果.将hTERT cDNA 3 565～3 583一段19 bp的DNA序列及其反向重复序列,用9 bp的连接序列连接后再接上5个T碱基,将此段DNA序列克隆至pPUR/U6载体U6启动子的下游,形成能在体内合成hTERT特异性短发夹状RNA的重组质粒载体pPUR/U6/hTERT.将pPUR/U6/hTERT与对照质粒pPUR/U6分别转染HepG2细胞.采用嘌呤霉素筛选和富集转染具有抗性的细胞.收集存活的细胞接种12孔板、提取RNA和蛋白质.以细胞计数法测定细胞的生长速度,RT-PCR和蛋白质印迹分析hTERT基因的表达,端粒重复放大测定法检测端粒酶活性,蛋白质印迹检测p53蛋白水平.与转染对照质粒pPUR/U6的细胞相比,转染pPUR/U6/hTERT的细胞其hTERT基因表达水平显著下降,端粒酶活性降低,细胞生长速度变慢,p53蛋白表达明显升高.以上结果表明,以DNA质粒为载体产生的内源性短发夹状siRNA能高效抑制hTERT基因的表达,有望成为基因功能研究的有力工具.     

肿瘤治疗的新领域--siRNA

siRNA(short interference RNA,siRNA)是21～23nt的短双链RNA,将哺乳动物细胞内特异基因的mRNA特异性降解而使基因失活,引起转录后沉默该基因的作用。本文针对siRNA在肿瘤治疗中的研究现状进行综述。     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

利用脊髓灰质炎病毒5''''NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒 (PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体 pSG5质粒上 ,分别构建了 4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明 ,pSG5 POL1 99和 pSG5 POL2 0 3质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录 ,表明两质粒可表达RNA聚合酶。将PV的 5'NCR序列插在载体 pGREENLANTERN 1的CMV启动子下游 ,构建了 pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒 ;用 LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREENLANTERN 1和pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒上 ,构建成 pLacZLANTERN 1和 pLacZLANTERN 1 5'NCR质粒。表达RNA聚合酶的质粒与 pLacZ 5'NCR调控表达报告基因的质粒共转染 ,明显提高了报告基因的表达水平 ,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体。     

RNA干涉技术(RNAi)应用研究进展

RNA干涉是通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,这一过程在拟南芥、线虫和真菌等多种模式植物中发现。RNAi是研究多种生物基因功能的有效手段,本文综述了RNA干涉的分子机理及其应用研究进展。     

小鼠胚胎干细胞中RNA干涉现象

报道了不同品系小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )系MESPU13、B3和R1中存在的RNA干涉 (RNAi)现象。应用脂质体法 ,将转录绿色荧光蛋白 (GFP)基因双链RNA(dsRNA)的载体 (pdsGFP)转染GFP标记的ES细胞 ,dsRNA的瞬时表达可引起ES细胞中的RNAi效应 ,即质粒转录的GFP基因的dsRNA能够显著降低ES细胞内相应的外源GFP基因的表达 ;同时 ,用电穿孔转染法将线性化的pdsGFP puro导入ES细胞中 ,筛选后 ,在 3 0 %左右的抗性克隆中GFP表达量明显降低 ,少数细胞内的干涉效率达到RT PCR检测不到的程度。在此基础上 ,构建了可转录ES细胞特异标记基因OCT 4基因片断dsRNA的载体 ,经基因打靶和抗性筛选得到了稳定整合的ES细胞克隆 ,随机扩增了 5 1个克隆 ,并对其中的 48个阳性克隆进行了PCR半定量检测 ,结果显示 :在 11个ES细胞克隆中具有显著的RNAi效应 ,干涉效率达到RT PCR检测不到的程度。这一结果表明 ,应用RNAi在不同品系ES细胞中研究哺乳动物及人的基因功能是可行的     

利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.     

RNA干扰对乙肝病毒基因的抑制作用

双链介导的遗传干涉的机制是1998年发现的。它通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列从而导致转录后水平的基因沉默。RNA干扰作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具已被广泛用于基因功能的研究以及疾病的治疗。利用小干扰RNA与乙肝病毒DNA通过共转染于HepG2肝癌细胞中使乙肝病毒基因沉默以达到抑制乙肝病毒复制作用。     

RNA干扰在疾病治疗方面的应用研究

RNA干扰是由双链RNA引起的序列特异的基因沉默现象。由于RNA干扰能在细胞组织及动物模型中沉默疾病相关基因,因此,RNA干扰也是各种疾病治疗的有效手段。在哺乳动物细胞内诱导RNA干扰可以通过导入小干扰RNA（siRNA）,或是以质粒、病毒为载体表达短的发夹RNA（shRNA）而实现。本文介绍了RNA干扰在疾病治疗方面的应用,并就其面临的挑战进行讨论。     

转录后基因沉默及植物病毒对它的抑制

转录后基因沉默是发生在细胞质中同源依赖的特定mRNA降解过程,也是生物体天然存在的对抗外源核酸(包括转基因、病毒)入侵的防御机制。概述转录后基因沉默的机制及双链RNA、21～25nt小RNA和RNA依赖的RNA聚合酶在其中的重要作用,以及抑制PTGS的植物病毒抑制子方面的研究进展。     

RNA干扰对乙肝病毒基因的抑制作用

双链介导的遗传干涉的机制是1998年发现的。它通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列从而导致转录后水平的基因沉默。RNA干扰作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具已被广泛用于基因功能的研究以及疾病的治疗。利用小干扰RNA与乙肝病毒DNA通过共传染于HepG2肝癌细胞中使乙肝病毒基因沉默以达到抑制乙肝病毒复制作用。     

RNA干涉的分子机制及技术研究进展

RNA干涉(RNA interference,RNAi)现象广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中,属于转录后水平的基因沉默(PTGS)。它利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,本重点介绍了RNA干涉的分子机制及技术应用等方面的进展,RNA干涉在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中将具有广阔的发展前景。