真核生物中的微小RNA及其功能研究进展

真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-coding RNA),在真核生物中发挥重要作用。一类为微小RNA(microRNA,miRNA),另一为小干扰RNA(siRNA)。miRNA大小为19～25nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP),在真核基因的表达调控,生长发育中起重要作用。siRNA在RNA干扰(RNA地 interference,RNAi)途径中起定位特异mRNA的作用。miRNA与siRNA有联系也有区别。miRNA在真核生物中的调控机制具有保守性。     

siRNA脱靶效应研究进展

RNA干扰过程中,siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实,siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,这种现象称为siRNA脱靶效应。多种真核生物中的RNA干扰实验证实了脱靶效应的存在。对脱靶机制的研究发现脱靶可能与模体匹配、结构和长dsRNA等有关,很多新方法被提出来预测脱靶概率和检测脱靶基因。通过利用siRNApool、化学修饰和生物信息学方法能够尽可能地降低脱靶效应,提高RNAi实验的质量。对脱靶效应方面的研究进行了总结论述。     

siRNA核糖分子化学修饰对RNAi功能的影响

RNA干扰(RNAi)是基于正常RNA生理调节反应,主要由小干扰RNA(siRNA)引发的转录后基因沉默现象.RNAi技术是基因功能研究的重要手段.目前困扰siRNA进入临床的主要困难有siRNA分子易降解、稳定性差、转运效率低、存在靶外效应和免疫刺激反应等.siRNA分子骨架中核糖化学修饰能够一定程度克服上述障碍,降低siRNA给药剂量,减少副作用,是siRNA进入临床最可能的方式.对核糖分子常用位点尤其是2-′羟基化学修饰后siRNA分子的药动学性状及RNAi功能做了分析.     

基于BP神经网络的siRNA活性预测

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA来起作用,特殊设计的siRNA能使靶基因发生特异性沉默,起到确定基因功能或沉默致病基因从而治疗疾病的目的。在RNAi技术的应用中,通常采用的是长度为19bp,正、反义链3'端各有2个不配对碱基的双链RNA(siRNA)。但针对靶基因不同位点设计的siRNA作用效果差别很大。影响siRNA效果的因素是多方面的,这些因素的作用又是非线性的。本文在研究影响siRNA作用效果的各种因素的基础上,对已经公开发表的实验数据进行特征提取,作为BP神经网络的训练数据,并将训练好的BP神经网络用于siRNA活性预测。     

siRNA抑制乙肝病毒的研究进展

乙型肝炎作为一种发病率高、死亡率高的传染性疾病,已严重威胁人类健康,乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）是诱发乙型肝炎的重要病因。目前,最主要的治疗方法是运用抗病毒药物控制病情,但这些药物都不能完全治愈乙型肝炎且复发率高。近年来,RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）逐渐成为有效、快速治疗乙型肝炎的新疗法。利用RNA干扰技术体外合成针对HBV基因的siRNA,选择适当的载体将其运送至靶细胞,使HBV基因沉默,从而抑制病毒复制,可有效达到治疗乙肝的效果。本文围绕siRNA沉默HBV基因的设计原理、递送载体、靶向策略、以及治疗效果与应用前景等方面进行了系统综述,为今后siRNA治疗乙肝的临床应用提供参考。     

小发夹RNA在稀有(鱼句)鲫胚胎中的表达

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面.多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达.这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等.为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和u6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP.通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有(鱼句)鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中.由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有(鱼句)鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测.研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达.研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑.     

干扰RNA的非靶免疫副作用及其siRNA序列设计与化学修饰

siRNA介导的RNA干扰技术已经成为基因功能研究和开展疾病治疗的有用工具.近年发现,siRNA在哺乳动物体内可激活天然免疫系统,诱导干扰素等炎症因子的分泌,并且可非特异性抑制某些非靶基因的表达,有可能极大限制RNA干扰技术的应用.进行高效特异性siRNA的设计和修饰,以保持或者增强siRNA的特异性靶基因沉默作用,又消除siRNA对机体的非靶免疫副作用,成为使siRNA安全有效应用于临床治疗的关键.     

siRNA与miRNA在生物基因调控中的沉默机制比较

siRNA和miRNA的沉默机制是生物基因调控的重要手段之一. 小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）是RNA干扰的引发物,激发与之互补的目标mRNA沉默. 非编码RNA中的微小RNA（microRNA,miRNA）,能够识别特定的目标mRNA,通过与mRNAs的3′ 非翻译区结合,影响该目标蛋白的翻译水平. siRNA和miRNA的基因调控机制对生物学研究及疾病的病因和治疗等有直接影响. 本文主要对siRNAs和miRNAs的生物起源及沉默机制进行比较性论述：提出Dicers酶蛋白、Ago蛋白以及20 nt~25 nt的双链RNAs的 3类大分子是RNA沉默的特征结构,并进行了说明性论述|总结性叙述了siRNA和miRNA的2类小分子经典沉默机制,并提出其异同点. 最后,本文根据近期研究进展,对siRNA和miRNA的生物起源及沉默机制提出了新的疑问.     

RNA干扰在疾病治疗方面的应用研究

RNA干扰是由双链RNA引起的序列特异的基因沉默现象。由于RNA干扰能在细胞组织及动物模型中沉默疾病相关基因,因此,RNA干扰也是各种疾病治疗的有效手段。在哺乳动物细胞内诱导RNA干扰可以通过导入小干扰RNA（siRNA）,或是以质粒、病毒为载体表达短的发夹RNA（shRNA）而实现。本文介绍了RNA干扰在疾病治疗方面的应用,并就其面临的挑战进行讨论。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

利用RNA干扰抑制p21WAF1/CIP1基因的表达及周期阻滞效应

目的：构建p21WAF1/CIP1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,观察其对p21WAF1/CIP1表达的影响和细胞周期的变化。方法：合成了针对p21WAF1/CIP1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,将重组质粒和带FLAG标签的p21WAF1/CIP1共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验RNA干扰（RNAi）敲低外源p21WAF1/CIP1的效果;将重组质粒单独转染293T人胚肾细胞,利用p21WAF1/CIP1抗体检测RNAi敲低内源p21WAF1/CIP1的效果;利用流式细胞仪检测敲低后细胞周期的变化。结果：测序证明构建了p21WAF1/CIP1siRNA真核表达载体;Westernblot和流式细胞分析证明,构建的siRNA能有效降低p21WAF1/CIP1基因的表达,并且使G1期细胞数减少14.03%,S期细胞增多13.45%。结论：构建了p21WAF1/CIP1siRNA的真核表达载体,该siRNA能有效抑制p21WAF1/CIP1基因的表达并部分解除了G1期阻滞。     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。     

Clinical advances of siRNA therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) enables efficient target gene silencing by employing a RNA interference (RNAi) mechanism, which can compromise gene expression and regulate gene activity by cleaving mRNA or repressing its translation. Twenty years after the discovery of RNAi in 1998, ONPATTRO? (patisiran) (Alnylam Pharmaceuticals, Inc.), a lipid formulated siRNA modality, was approved for the first time by United States Food and Drug Administration and the European Commission in 2018. With this milestone achievement, siRNA therapeutics will soar in the coming years. Here, we review the discovery and the mechanisms of RNAi, briefly describe the delivery technologies of siRNA, and summarize recent clinical advances of siRNA therapeutics.     

miRNA，siRNA，saRNA与基因表达调控

近年来的研究发现,生物体内存在着大量的非编码RNA（non．codingRNAs,ncRNA）,它们在染色质修饰、基因转录、RNA剪接和mRNA翻译等多种水平上参与了基因表达的调控。ncRNA中的小分子RNA如miRNA能够识别特定的目标mRNA,通过与mRNAs3’非翻译区结合,影响mRNA转录及蛋白质翻译;siRNA是RNA干扰的引发物,能够导致与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制相应基因表达;saRNA是目前最新发现的一种靶向目的基因启动子区的在转录水平激活目的基因表达的dsRNA。miRNA、siRNA和saRNA在生成机制、作用途径等方面关系密切,既区别又相互联系,小分子RNA的研究将是今后分子生物学的研究热点之一。     

高效siRNA设计的研究进展

RNA干扰(RNA interference, RNAi) 是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的保守进化机制, 其本质是siRNA与靶向mRNA特异结合、并由RISC介导其降解, 从而阻止mRNA的翻译, 导致基因沉默。因此, RNAi可以作为基因功能研究、基因治疗等的新工具。但是, 随机设计的siRNA之间沉默效应差别很大。如何针对靶基因设计特异、高效的siRNA就成了一个关键的问题。文章对siRNA设计原则的研究进展进行了总结论述。     

A siRNA system based on HSP70 promoter results in controllable and powerful gene silencing by heat‐induction

RNAi is a powerful tool for gene‐specific knockdown and gene therapy. However, the imprecise expression of siRNA limits the extensive application of RNAi in gene therapy. Here we report the development of a novel controllable siRNA expression vector pMHSP70psil that is initiated by HSP70 promoter. We determined the efficiency of the controllable siRNA system by targeting the gama‐synuclein (SNCG) gene in breast cancer cells MCF‐7. The results show that the controllable siRNA system can be induced to initiate siRNA expression by heat‐induction. The silencing effect of SNCG occurs at a relatively low level (10.1%) at 37°C, while it is significantly increased to 69.4% after heat induction at 43°C. The results also show that the controllable siRNA system inhibits proliferation of cancer cells by heat‐shock. Therefore, this RNAi strategy holds the promise of the high efficiency in gene knockdown at targeted times and locations, avoiding systemic side effects. It provides, for the first time, an approach to control siRNA expression by heat‐shock. © 2013 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 29:1289–1297, 2013