静电纺丝的主要参数对PLGA纤维支架形貌和纤维直径的影响

EST(expressed sequence tags,EST)是一段长约150～500bp基因表达的外源序列片段,是由大规模随机挑取的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。一个EST代表生物某一时期的某种组织或细胞的一个表达基因。主要综述了EST技术的原理方法,哺乳动物早期胚胎研究的理论基础以及EST技术在早期胚胎研究方面的应用,并讨论了利用EST进行研究分析的发展趋势。     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA.进而运用抑制消减杂交技术(SSH)对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个eDNA片段为新的EST,提交GenBank后被接受并给予了新序列编号.这1 7个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为今后进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础.通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失.     

EST分析技术在鸡基因组学研究中的应用

表达序列标签（EST）是由大量随机取出的cDNA库克隆经测序得到的组织或细胞基因组的一段cDNA序列,一个EST代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因。综述了EST分析技术在鸡基因组研究中的应用。如用于鉴定、发现和预测鸡的新基因,用于基因图谱的绘制,用于筛选基因的单核苷酸多态性（SNP）位点,用于基因表达分析和基因芯片制作等。EST数据库和生物信息学的联合分析技术在推动家鸡后基因组的研究中发挥着重要的作用。     

水稻胚胎发育过程相关基因的鉴定(简报)

为了研究水稻胚胎发育的分子机制,我们运用抑制差减杂交(SSH)技术鉴定了胚胎发育早期(授粉后5-7天)和晚期(授粉后15-17天)优势表达的基因.结果发现在胚胎发育早期和晚期优势表达的表达序列标签(EST)分别为47个和15个,这些EST可分为新陈代谢、蛋白合成、蛋白修饰、细胞防御或胁迫、转运运输、转译、DNA或RNA结合等多种类别.其中有32%的EST在GenBank的生物信息数据库中没有同源序列.从两个SSH文库中随机抽取11个EST分别在5DAP和15DAP水稻分化的胚胎中进行RT-PCR验证.结果显示SSH文库所获得的EST符合建库要求.对这些EST所代表的基因作进一步研究将有助于了解其在水稻胚胎发育中的生物学功能.     

用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因

mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 .     

兔单个植入前克隆胚胎cDNA文库的构建

人与小鼠和牛在正常胚胎植入前发育过程中基因活化的研究已经取得了长足的进展 ,但是还没有对同期克隆胚胎相关研究的报道 .利用单个家兔植入前移核重构胚胎成功地构建了MⅡ卵母细胞及发育至 4 、8 细胞期的胚胎和囊胚的特异性cDNA文库 .并用 β肌动蛋白和LAPTM4α证实这类文库是可靠的 .以 8 细胞期移核重构胚cDNA文库为例 ,随机挑取克隆进行测序分析 :其中 2 3的基因EST片段可以在GenBank或EST库中找到同源序列 ,约 1 3的EST片段属于未知的新片段 ,表明这是一类重要的新兴基因资源库 (期特异性EST库 ) .这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法 ,解决了胚胎研究材料受限的问题 ,在时间上更加精确 ,更符合胚胎发育的规律 ,也能够更加准确地反映出一些克隆胚胎的异常表型 ,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎再程序化基因表达的一种有效手段 .     

用表达性差异显示分析技术分离人胎肝组织选择性表达基因

目的：建立4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库,为研究胚胎肝组织特异表达基因提供有力的工具。方法：采用表达性差异显示分析（representational difference analysis,RDA) 技术建立4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库,并测定部分克隆核苷酸序列,以竞争PCR检测代表性基因的差异表达。结果与结论：以珠蛋白家族基因为标志,所建差减cDNA文库中α－珠蛋白家族基因的表达频率较未差减cDNA文库增高7倍,同时该文库也含有多种与肝生长密切相关的基因,表明RDA技术确是研究差异表达基因的有效手段,所建EST库富集胎肝特异表达基因。部分克隆序列分析获得2种未报道序列,其中一株含有丝／苏氨酸激酶结构域,表明可望从此库中分离具有重要未知功能的新基因。     

小鼠和鸡的类E1酶新基因UBAL的克隆和表达分析

根据含有UBA_NADbindingdomain的EST序列,利用同源性序列查找和EST拼接的方法,克隆得到鼠、鸡的新基因UBAL(ubiquitin-activatingenzymelikeprotein),它们都具有泛素活化酶Uba1的保守结构域Ⅰ,可能的ATP结合序列GVGGVG和Cys活性位点.用半定量RT-PCR分析11种成年小鼠组织的mUBAL表达量,显示mUBAL在成年小鼠多种组织中都有表达,在肾、睾丸、脑、心脏中尤为丰富.用mUBAL的编码区为探针进行的小鼠胚胎整体原位杂交显示,mUBAL在胚胎发育早期即开始表达,并随着前内脏内胚层(AVE)的向前迁移而迁移,随后在胚胎的端脑区特异性表达.与小鼠胚胎的表达谱相类似,gUBAL在HH14、HH16和HH18期鸡胚中的表达主要集中在头部.根据mUBAL和gUBAL的序列相似性保守结构域和活性位点,可以初步断定它们可能是类泛素活化酶E1的新成员,可能通过活化类泛素蛋白参与胚胎脑部的发育和调控成体组织的功能.     

小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1的克隆

从已获得的运用抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)分离、克隆和筛选代表8-细胞早期胚胎和紧密化8-细胞胚胎差别表达基因的ESTs片段(GenBank登录号：BQ740263、BQ740251)入手,经比较二者的同源性发现这两个EST末端反向互补,拼接成一个cDNA片段,经分析此序列包含一个完整的阅读框,提交给GenBank,登录号为AY134859。根据此序列设计引物从小鼠8-细胞紧密化胚胎cDNA中经PCR扩增出目的片段,克隆入pUCm—T载体后测序而获得全长cDNA,为小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1,分析比较证明Crg1基因与AY134859基本吻合。Crg1基因的cDNA全长为810bp,只有一个外显子,编码由150个氨基酸组成,分子量理论值为17．67kD的蛋白质。与最新的小鼠基因组工作草图进行电子杂交,该基因被定位在小鼠的14号染色体上。RT—PCR实验证明在小鼠植入前各个时期的胚胎、小鼠胚胎干细胞中均有表达,在小鼠胚胎成纤维细胞中没有表达。半定量RT—PCR实验证明Crg1基因在紧密化胚胎中表达较8—细胞胚胎高。采用Northern—blot手段分析Crg1基因在成年小鼠的8种组织中的表达情况,结果表明该基因只在小鼠卵巢中有微弱的表达,转录本大小为1．2kh,而在成年小鼠的脑、心脏、肾、睾丸、肝脏、肺、脾等中没有表达。研究表明,Crg1基因可能与小鼠胚胎紧密化及保持细胞的全能性相关。     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA。进而运用抑制消减杂交技术（SSH）对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个cDNA片段为新的EST,提交GeneBank后被接受并给予了新序列编号。这17个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础。通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失。Abstract: A total of 181 8-cell embryos and 241 8-cell compacted embryos were collected respectively from Kunmingbai mouse and their cDNA was synthesized directly using SMART PCR. Genes, which expressed differently between early 8-cell embryos and 8-cell compacted embryos, were investigated using the method of suppression subtractive hybridization (SSH). Then PCR production was cloned into pUCm-T vector respectively according to the size after isolated and purified. Twenty-seven ESTs (expressed sequence tags ) of genes expressed differently between early 8-cell embryos and 8-cell compacted embryos have been isolated and cloned. seventeen of those were novel ESTs after being confirmed by blaster matching in GenBank for homology analysis. And they were banked into GenBank with accession numbers. All 17 ESTs might be for novel genes related to compaction in compacted embryos. And longer ESTs may be obtained by cloning according to the size.     

植物基因组表达序列标签(EST)计划研究进展

植物表达序列标签(EST)计划是随机挑选cDNA克隆,并对其3′或5′端进行大规模一次性测序,将得到的150～500 bp长度的DNA片段与数据库中的序列进行比较,获得对基因组结构、组织、表达等认识的基因组研究策略.就近年来国际植物EST计划的实施情况、植物EST计划的研究范围、生物信息学在EST研究中的应用、EST数据库及查询、植物EST研究中遇到的问题等方面内容进行了综述.     

生物信息学辅助定位及延伸辐射诱导未知表达序列标签

研究辐射诱导的基因表达调控对于认识细胞对辐射损伤的应激反应有重要意义.在低剂量辐射诱导新基因RIG1表达序列标签(expression sequence tag,EST)片段的基础上,通过非克隆cDNA文库和RACE(rapid amplification of cDNA end)技术获得了其3′末端.依据实验得到的这两段EST序列所提供的信息,通过生物信息学分析将RIG1基因初步定位在20号染色体.对20号染色体RIG1区基因组序列进行外显子扫描,发现预测的外显子正好与实验得到的EST相吻合.利用预测的外显子设计特异引物,成功地克隆了RIG1基因全长序列.同时,对20号染色体RIG1区的生物信息学分析表明,在RIG1基因的上游存在启动子区,从而确定了RIG1基因的基因组序列.因此,通过生物信息学辅助设计实验,快捷地定位及延伸了未知EST片段RIG1,基本完成了RIG1的全基因、基因组序列及染色体定位研究.     

Quox—1基因同源序列在人胚早期发育中的表达

以Ｑｕｏｘ－１基因的特异性片段ｂ２为探针与人基因ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,结果显示,人基因组中存在Ｑｕｏｘ－１基因的同源序列。结果表明其表达有明显的时间和空间特异性。胚龄３０天以前,Ｑｕｏｘ－１基因的同源序列在人胚包神经管等许多部位表达,３０天以后表达部位局限于脊索、心肌细胞、生机节、消化道上皮及周皮等处。     

47个早期人胚胎低丰度表达基因ESTs筛选及结果分析

构建高质量ｃＤＮＡ文库在基因克隆、ｍＲＮＡ差异展示、表达序列标签测序和基因定位等研究中具有十分重要的作用。为了从早期胚胎中分离人类新基因,构建了受精后３周龄的人ｃＤＮＡ文库,用标记的一链ｃＤＮＡ探针对该文库的６５０８个克隆子进行菌落原位杂交,得到１６７７个无任何杂交信号的低丰度表达克隆子,从中随机挑选了４７个进行５′端部分测序,将测序结果与三大基因库进行序列同源性比较,发现１８个克隆（３８．３％）