猪瘟病毒结构蛋白E~(rns)在E.coli中的高效表达及纯化

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的高度接触性传染病,是严重危害养猪业的传染病之一。CSFV基因组为单股正链RNA分子,长约12.3kb,仅编码一个开放性阅读框。位于5′端的囊膜糖蛋白Erns、E1和E2构成了CSFV的外壳,其中Erns     

针对猪瘟病毒E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体的表达及抗病毒活性鉴定

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是严重危害养猪业的一种烈性传染病,常造成巨大的经济损失,是世界动物卫生组织要求必须申报的动物疫病之一。猪瘟的病原是猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),CSFV的结构蛋白由衣壳蛋白(C)和囊膜糖蛋白(E~(rns)、E1、E2)构成。E2蛋白是CSFV主要的保护性抗原,可以诱导机体产生中和抗体,从而抵抗CSFV的感染。此前,本团队制备了一株针对CSFV E2蛋白的鼠源单克隆抗体HQ06。文中将HQ06抗体重链和轻链可变区基因与猪源恒定区基因嵌合后克隆至真核表达载体,利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制备一株针对CSFV E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体c HQ06。应用ELISA、Western blotting试验证实了c HQ06与CSFV E2蛋白具有良好的反应性;中和试验结果表明c HQ06可以中和CSFV。综上所述,本研究应用CHO细胞稳定表达了具有良好反应性和中和活性的针对CSFV E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体c HQ06,为研究CSFV E2蛋白结构、功能以及开发新型的CSFV诊断和治疗制剂奠定基础。     

猪瘟病毒结构蛋白E^ms在E．coli中的高效表达及纯化

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪的高度接触性传染病,是严重危害养猪业的传染病之一。CSFV基因组为单股正链RNA分子,长约12．3kb,仅编码一个开放性阅读框。位于5’端的囊膜糖蛋白E^ms、E1和E2构成了CSFV的外壳,     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种毁灭性传染病,给养猪业造成重大经济损失。猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)是一株非常安全、有效的优秀弱毒疫苗,对各年龄和品种的猪都极其安全,同时对不同基因亚型的CSFV均能提供有效的免疫保护。在现地,CSFV和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的现象时常发生,有必要研制针对这两种病毒混合感染的二价疫苗。本研究首次构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组C株,并评价了其在体内外的特性。结果表明,该重组病毒与C株具有相近的体外增殖特征,能够稳定表达Cap蛋白,在家兔体内具有与C株相似的生物学表型,在免疫家兔后10 d,抗CSFV E2抗体全部转阳,然而抗Cap抗体未能转阳。本研究为进一步优化表达PCV2Cap蛋白的重组C株奠定了基础。     

猪瘟表面抗原E2-Erns蛋白在亚麻芥种子中的表达及活性分析

猪瘟病毒能导致猪的高度接触性传染病,对养猪业危害极大。由于传统猪瘟疫苗在使用及生产中存在诸多不足,促使科研工作者研制开发新型猪瘟疫苗。猪瘟病毒主要保护性抗原是E2蛋白和Erns蛋白,能够引起机体的免疫反应。植物表达体系具有表达效果好和生产成本低等优点,随着近些年开始出现利用转基因植物生产蛋白产品的技术,植物生物反应器越来越引起广泛关注。植物生物反应器具有完整的真核细胞表达系统,能够进行准确的蛋白翻译后加工,能较好的保留蛋白生物活性。为利用转基因植物生物反应器制备猪瘟的亚单位可饲疫苗及其商品化提供实验依据,本研究拟构建种子特异性启动子驱动的目的基因的表达载体,并转导至亚麻芥生物反应器中,表达猪瘟病毒E2-Erns融合蛋白。利用表达的猪瘟病毒E2-Erns蛋白以口服接种的方式进行小鼠模型的免疫实验,验证目标蛋白的抗原性。     

共表达PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中.为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒.间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达,将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫.结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖:部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组.结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答.     

猪瘟病毒E2蛋白表位分析及其单克隆抗体可变区cDNA测序

猪瘟病毒(CSFV)囊膜表面结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程.本文采用抗CSFV(AlfortTubingen毒株)E2结构蛋白的单克隆抗体c2410和a18,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,对CSFV E2蛋白表位进行分析.研究发现单克隆抗体c2410和a18识别同一线性表位,定位于E2蛋白的832-837位氨基酸(SPTTLR),但二者在ELISA和免疫印迹分析中对不同表(拟)位的反应性存在差异.自杂交瘤细胞中提取总RNA,对单克隆抗体轻链和重链可变区cDNA进行序列分析.结果表明c2410和a18虽然来源于同一批次融合的杂交瘤细胞系,识别同一表位,但仍属于不同的单克隆抗体.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒.小鼠免疫试验表明,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应.攻毒保护试验表明,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(Hog cholera lap-inized virus, HCLV)的攻击;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

猪瘟病毒糖蛋白E^rns中和表位的鉴定和比较

猪瘟病毒 (CSFV)囊膜结构糖蛋白Erns(gp4 8)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导CSFV感染细胞的过程。Erns具有RNA酶活性 ,影响病毒自身复制并涉及对病毒的中和效应。采用抗CSFValfortT櫣ｂｉｎｇｅｎ毒株Ｅｒｎｓ糖蛋白的 1B5 ,b4_2 2和 2 4 16单克隆中和抗体 ,筛选噬菌体展示的 12肽随机肽库 ,进行Erns中和表位的鉴定和比较 ,获得分别针对 1B5、b4_2 2和 2 4 16单克隆抗体的 3个主要中和表 (拟 )位基序WxNxxP、DKNR (Q)G和A(T)CxYxKN ,分别定位于Erns的 35 1位～ 35 6位或 348位～ 35 0位、384位～ 386及 32 2位～ 32 3位、380位～ 386位氨基酸区域。分析表 (拟 )位基序与单克隆抗体的免疫反应性差异。b4_2 2和 2 4 16单克隆抗体识别基序存在共有序列KN ,识别Erns中的相似抗原区 ,但其侧翼序列及免疫印迹、免疫荧光抗体抑制试验结果均存在显著差异     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.