DNA拓扑异构酶

天然存在的DNA是以超螺旋形式存在的,DNA转录、复制,基因表达时必须解开超螺旋,DNA超螺旋的形成和解旋是由一类称为DNA拓扑异构酶的蛋白质介导的,本文对该酶的分类,各类酶的功能特点、作用机制及其生物学意义作一简要综述。     

新生霉素抑制拓扑异构酶Ⅱ对多瘤病毒DNA合成的影响

本文报告了Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂——新生霉素对多瘤病毒DNA合成的抑制作用,发现新生霉素对细胞和病毒DNA的体外合成具有不同的抑制曲线。新生霉素在复制过程中抑制复制中间物转变成成熟的病毒DNA分子的过程,同时影响病毒DNA分子的负超螺旋密度。本文结果提示Ⅱ型拓扑异构酶是病毒DNA复制末期所必须的酶。     

核多角体病毒感染昆虫细胞的DNA拓扑异构酶性质的研究

核多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus)的核酸是双股环状DNA,在病毒颗粒中呈超螺旋状态。超螺旋DNA复制时,一般皆有超螺旋解旋过程。为了解这一机制,本文报道了从NPV感染的家蚕中肠组织中分离细胞核,经过羟基磷灰石、磷酸纤维素柱层析,ssDNA-纤维素亲和层析,纯化了DNA拓扑异构酶I,SDS-PAGE测定分子量为47kd,最适Mg~(++)浓度约为5mM。AcNPV感染的TN368细胞DNA拓扑异构酶I总活力较正常细胞酶活力高1～3倍,且活力的提高与病毒增殖平行。讨论了昆虫细胞DNA拓扑异构酶I的性质及其与NPV复制的关系。     

Nature揭示染色体复制新机制

在染色体的复制过程中，复制叉前端区域的亲代DNA分子常常会形成正超螺旋。尽管过去的研究证实为了确保复制又向前推进，常通过拓扑异构酶使DNA发生短暂的断裂从而释放出超螺旋产生的应力。还有一些科研团体则认为前进的复制又是沿着DNA螺旋发生旋转进而减少超螺旋的。然而一直以来科学家们对于在真核生物中线性染色体复制诱导的超螺旋应力的释放机制仍了解得不是很清楚。     

超氧化物歧化酶切割超螺旋DNA的活性

在体外系统中,发现超氧化物歧化酶(SOD)具有切割超螺旋DNA的活性. 猪血和牛血Cu/Zn-SOD以及烟草Mn-SOD都能将超螺旋DNA转变为非超螺旋结构的缺刻环状DNA,进一步产生线状DNA. 它们只作用于超螺旋DNA而不作用于线状DNA. 这个事实排除了SOD样品中污染核酸酶的可能性. 用H₂O₂、胍基抑制或蛋白酶降解的实验结果表明,这两种酶的活性中心处于酶蛋白的不同部位.     

Sanger链中止法的新进展——以M13为克隆的运载体进行DNA序列分析(续)

三.M13mpX复制形式(RF)的制备(图1-3) 虽然M13mpX是单链的噬菌体,一旦它感染到寄主细胞后,便成为双链超螺旋的复制形式(图3)。这样既便于限制性内切酶在其MCS处切开,也能通过连接酶的作用把待测DNA片段接进去,构成一个重组体。     

蛋白质与核酸的相互作用

(一)复制、转录和翻译水平上蛋白质与核酸的相互作用蛋白质和核酸是组成生物体的两大重要物质。蛋白质是基因表达的产物,基因的表达离不开蛋白质。它们相互依存,彼此制约。蛋白质与核酸的相互作用存在于生物体内基因表达的各个水平之中。在DNA复制过程中,链的引发、延伸、终止所涉及的反应都由相应的酶催化,还需要许多具有调节功能的蛋白质对DNA复制进行调节。在大肠杆菌中,复制过程就需要三十多种蛋白质的协同作用。研究DNA聚合酶、拓扑异构酶、解链酶、解旋酶、连结酶等与复制有关的     

pBR322 DNA的超螺旋波动

开环状pBR322 DNA在不同溴乙啶浓度下通过DNA联接酶转变为闭环状分子。除去溴乙啶后,每种样品中都含有一组超螺旋数即拧数(W_r)不同的闭环状分子。这些样品和天然pBR322DNA的W_r都直接用琼脂糖凝胶电泳加以分析和测定。作者观察到用同样的培养剂在37℃培养同一菌株所获得的不同pBR322DNA样品,其超螺旋数值可以在相当大的范围内波动。为了便于比较不同的超螺旋DNA,作者采用了一种新的单位——超螺旋跨距,它可能有助于进一步研究环状双链DNA的本质。     

pBR322 DNA的超螺旋波动

开环状pBR322 DNA在不同溴乙啶浓度下通过DNA联接酶转变为闭环状分子。除去溴乙啶后,每种样品中都含有一组超螺旋数即拧数(W_r)不同的闭环状分子。这些样品和天然pBR322 DNA的W_r都直接用琼脂糖凝胶电泳加以分析和测定。作者观察到用同样的培养剂在37℃培养同一菌株所获得的不同pBR322 DNA样品,其超螺旋数值可以在相当大的范围内波动。为了便于比较不同的超螺旋DNA,作者采用了一种新的单位——超螺旋跨距,它可能有助于进一步研究环状双链DNA的本质。     

蓖麻蚕rDNA的十字结构

单链核酸酶——S1酶在超螺旋pBR322上有专一的切点。这是因为在pBR322超螺旋分子上邻近的反向重复顺序所形成的十字结构具有单链区能为S1酶作用。真核细胞基因——蓖麻蚕rDNA的完整重复单位插入pBR322所组建的质粒pARⅢ,其超螺旋分子的顺序上也有S1敏感区。用S1酶和PstⅠ酶双酶切可以产生特定长度的片段。pARⅣ是带有pARⅢEeoRⅠ(2)-BamHⅠ(2)片段的次级克隆,超螺旋pARⅣDNA经S1酶和PstⅠ酶双酶切所显示的S1酶切点与pARⅢ一致。由于对S1酶的相对敏感度不同,在pARⅢ和pARⅣ分子中原有的pBR322上的S1酶切点被掩盖。真核细胞DNA的十字结构在染色质水平上的功能意义有待进一步探讨。     

核糖体失活蛋白与超螺旋DNA相互作用的原子力显微镜直接观察

运用原子力显微镜研究了核糖体失活蛋白 (RIP)与超螺旋DNA相互作用 ,发现这类毒蛋白 (克木毒蛋白和蓖麻毒蛋白A链 ) ,既能与超螺旋形式的DNA结合 ,又能结合在超螺旋DNA分子中未解旋的双链环区 .在与超螺旋DNA结合后 ,引起超螺旋DNA构象变化以利解旋并与双链DNA结合 ,进而将松弛的DNA双链切成缺口或线性形式 .这说明RIP是一种超螺旋DNA结合蛋白 ,并表现出依赖超螺旋的DNA内切酶活性     

高中生物学“DNA分子复制”教学中的2点误区

误区1：DNA分子复制时不需要DNA连接酶。 例：下面哪种酶在遗传信息的传递和表达过程中不起作用（ ）。 A．DNA连接酶 B．DNA聚合酶 C．RNA聚合酶 D．解旋酶     

质粒pUC18 DNA的螺线管型超螺旋结构

理论上,游离的超螺旋DNA可以采取两种结构形式：互缠式超螺旋和螺线管型超螺旋。前者早已被透射电子显微镜和原子力显微术的研究所证实,而后者却仍然缺乏足够的证据。使用温和的清亮裂解液法,从DNA拓扑酶野生型大肠杆菌HB101细胞抽提质粒pUC18 DNA。经CsCl-EB平衡密度梯度超离心分离获得超螺旋pUC18 DNA和松弛型pUC18 DNA(DNA Ⅱ）。纯化DNA分别用疏水必不容放亲水性溶剂系统的细胞色素单分子层展开技术制备电子显微镜标本。观察结果显示：在疏水性的甲酰胺－水展开系统中,DNA采取通常的互缠式结构;在含有1.5mmol/L醋酸铵的水介质中制备的超螺旋DNA标本,DNA采取线圈型结构,测得pUC18 DNA（单体）分子这种结构的外直径约为43.8nm,内直径约为2nm。在相同亲水介质中松弛型pUC18 DNA采取典型的螺线管型结构,其单体平均外直径约为53.1nm,内直径约为17.2nm。表明：在疏水介质中超螺旋DNA趋向于采取互缠式结构,而在亲水介质中DNA则要取螺线管型结构。DNA链之间可能存在非共价相互作用以维持这种结构。螺线管型结构可能是水溶液中的超螺旋DNA分子普遍的存在形式。     

病毒酶的研究及其进展

病毒的主要生物学特性之一是只有一种类型的核酸为其基因组(RNA或DNA),并必须在活细胞中增殖。虽然病毒复制需要细胞组分参与,但病毒基因编码的酶在病毒复制中的作用已日益受到重视。各种不同的病毒具有不同的病毒酶,包括复制核的酶、整合人细胞染色体的整合酶、引发(priming)DNA     

复制酶体的瞻望和疑问

由若干酶组成的复合体参与双链DNA分子复制过程。这种活性蛋白质复合体称为复制酶体(replitase),而具有这些酶活性的蛋白质并不能独立起作用。这种复合体在DNA复制(S期)开始时才由其各种成分装配而成,而在细胞周期的Gl期则不复存在。在真核细胞的复制酶体中,参与dNTP生物合成的酶和参与DNA复制的蛋白质结合在一起。在此复合体被装配前,细胞内先合成了大量“粘合”蛋白,以便将这些有关的蛋白质粘合在一起。在真核细胞内是否有这样的复制酶体存在是多年来一个有争论的问题。作者认为真核细胞中的复制酶体可能由细胞核内、外的两个蛋白质复合体所组成,并由两者协同完成DNA复制。如果复制酶体的存在得到证实,将会对诸如细胞周期、DNA复制、癌症发生、抗癌化学疗法和抗代谢物的生物学作用等理论,产生相当大的影响。     

酶切法鉴定质粒的亚型

商品化质粒小量抽提试剂盒制备的质粒DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测可见2条亮带,分别回收2条亮带,使用限制性内切酶分别消化,再用琼脂糖凝胶电泳检测,依据质粒的亚型(超螺旋、线性、开环)在以琼脂糖凝胶为介质的电场中的移动速度不同,鉴定出制备的质粒DNA电泳图中的2条亮带分别是超螺旋质粒和开环质粒。     

DNA拓扑异构酶的分型

ＤＮＡ拓扑异构酶的分型郑晓飞孙志贤（军事医学科学院放射医学研究所,北京１００８５０）关键词ＤＮＡ拓扑异构酶ＤＮＡ拓扑异构酶是真核细胞和原核细胞中的基本酶。ＤＮＡ拓扑异构酶在细胞生命过程中起着重要作用,如在ＤＮＡ复制、修复、转录、重组中解开在复制和重组...     

人源DNA聚合酶δ研究进展

在真核生物染色体DNA复制过程中主要涉及三种DNA聚合酶:α(Polα),δ(Polδ)和ε(Polε)。人源DNA聚合酶δ是p125,p68,p50,p12四个亚基构成的异源四聚体,属于DNA聚合酶B家族,具有5’-3’聚合酶催化活性和3’-5’核酸外切酶活性,是染色体DNA复制过程中最主要的复制酶,同时还参与多种形式的损伤修复,在保证基因组结构的完整性和遗传稳定性方面具有重要的意义。由于其重要的生物学功能,目前引起人们更多的关注和重视。对人源DNA聚合酶δ的分离纯化方法及涉及DNA复制和损伤修复过程中酶学功能等方面的最新研究进展进行综述。     

重组质粒pVAX1-PENK大规模制备研究

目的：建立质粒pVAX1-PENK的大规模制备2--艺。方法：对大肠杆菌工程菌DH5α-pVAX1-PENK进行补料发酵,利用自行发明的连续碱裂解过程对菌体进行裂解,经超滤浓缩后,用Sepharnse 6 Fast Flow层析柱分离DNA与RNA,再经Plasmidselect Xtra层析柱分离超螺旋质粒DNA与开环或线性质粒DNA,最后经Source 15Q层析柱精制质粒DNA。结果：发酵获得质粒pVAX1-PENK的产率为182mg／L,经碱裂解及层析分离后,最终制备的质粒DNA超螺旋比例大于98％,总回收率为60.5％,纯度（D260nm／D280nm）为1.8～2.0。结论：建立的质粒DNA生产工艺可以制备大量高纯度的质粒DNA,并避免了使用动物源性的酶及有毒试剂。     

DNA引发酶及其在肿瘤增殖和治疗中的作用

DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链,由DNA引发酶合成约7～10个核苷酸的RNA引物．DNA聚合酶利用引物提供自由的3′-OH末端合成新的DNA链。DNA引发酶在DNA复制的起始中起重要作用,而DNA复制是肿瘤细胞增殖的关键,抑制DNA引发酶活性,使引物的合成或延长受阻．DNA复制受抑制,肿瘤细胞不能增殖,从而达到抗肿瘤的目的。因此DNA引发酶是抗肿瘤药物研究的一个理想靶点。