超氧化物歧化酶切割超螺旋DNA的活性

在体外系统中,发现超氧化物歧化酶(SOD)具有切割超螺旋DNA的活性. 猪血和牛血Cu/Zn-SOD以及烟草Mn-SOD都能将超螺旋DNA转变为非超螺旋结构的缺刻环状DNA,进一步产生线状DNA. 它们只作用于超螺旋DNA而不作用于线状DNA. 这个事实排除了SOD样品中污染核酸酶的可能性. 用H₂O₂、胍基抑制或蛋白酶降解的实验结果表明,这两种酶的活性中心处于酶蛋白的不同部位.     

分子遗传学简介

复制过程中所需要的酶 完成复制过程是需要借助于许多酶类及特异蛋白 质的。所以我们简述一下几种主要酶与蛋白质的作 用,将有助于加深理解DNA复制过程。 解曲酶(swivelase) 它能够解开闭环DNA的 超螺旋结构的卷曲,使其形成一个开环的DNA（图32). 解开超螺旋的卷曲是有利于DNA复制的。     

质粒pUC18 DNA的螺线管型超螺旋结构

理论上,游离的超螺旋DNA可以采取两种结构形式：互缠式超螺旋和螺线管型超螺旋。前者早已被透射电子显微镜和原子力显微术的研究所证实,而后者却仍然缺乏足够的证据。使用温和的清亮裂解液法,从DNA拓扑酶野生型大肠杆菌HB101细胞抽提质粒pUC18 DNA。经CsCl-EB平衡密度梯度超离心分离获得超螺旋pUC18 DNA和松弛型pUC18 DNA(DNA Ⅱ）。纯化DNA分别用疏水必不容放亲水性溶剂系统的细胞色素单分子层展开技术制备电子显微镜标本。观察结果显示：在疏水性的甲酰胺－水展开系统中,DNA采取通常的互缠式结构;在含有1.5mmol/L醋酸铵的水介质中制备的超螺旋DNA标本,DNA采取线圈型结构,测得pUC18 DNA（单体）分子这种结构的外直径约为43.8nm,内直径约为2nm。在相同亲水介质中松弛型pUC18 DNA采取典型的螺线管型结构,其单体平均外直径约为53.1nm,内直径约为17.2nm。表明：在疏水介质中超螺旋DNA趋向于采取互缠式结构,而在亲水介质中DNA则要取螺线管型结构。DNA链之间可能存在非共价相互作用以维持这种结构。螺线管型结构可能是水溶液中的超螺旋DNA分子普遍的存在形式。     

质粒pUC18 DNA分子构象的多样性与线圈型超螺旋DNA

从大肠杆菌HB101细胞制备的质粒pUC18 DNA可被双向琼脂糖凝胶电泳分离成6组电泳行为不同的结构成分.超螺旋pUC18 DNA的两种结构形式:互缠型超螺旋与线圈型超螺旋构象同时存在于这种DNA样品中.在离子强度等环境条件改变时这两种DNA构象可以发生互变.DNA拓扑异构酶能改变线圈型DNA在样品中的含量.线圈型pUC18 DNA的电子显微镜表观为面包圈形,直径约45nm.实验事实表明线圈型超螺旋DNA是不依赖组蛋白而独立存在的一种结构实体.     

pBR322 DNA的超螺旋波动

开环状pBR322 DNA在不同溴乙啶浓度下通过DNA联接酶转变为闭环状分子。除去溴乙啶后,每种样品中都含有一组超螺旋数即拧数(W_r)不同的闭环状分子。这些样品和天然pBR322DNA的W_r都直接用琼脂糖凝胶电泳加以分析和测定。作者观察到用同样的培养剂在37℃培养同一菌株所获得的不同pBR322DNA样品,其超螺旋数值可以在相当大的范围内波动。为了便于比较不同的超螺旋DNA,作者采用了一种新的单位——超螺旋跨距,它可能有助于进一步研究环状双链DNA的本质。     

核糖体失活蛋白与超螺旋DNA相互作用的原子力显微镜直接观察

运用原子力显微镜研究了核糖体失活蛋白 (RIP)与超螺旋DNA相互作用 ,发现这类毒蛋白 (克木毒蛋白和蓖麻毒蛋白A链 ) ,既能与超螺旋形式的DNA结合 ,又能结合在超螺旋DNA分子中未解旋的双链环区 .在与超螺旋DNA结合后 ,引起超螺旋DNA构象变化以利解旋并与双链DNA结合 ,进而将松弛的DNA双链切成缺口或线性形式 .这说明RIP是一种超螺旋DNA结合蛋白 ,并表现出依赖超螺旋的DNA内切酶活性     

pBR322 DNA的超螺旋波动

开环状pBR322 DNA在不同溴乙啶浓度下通过DNA联接酶转变为闭环状分子。除去溴乙啶后,每种样品中都含有一组超螺旋数即拧数(W_r)不同的闭环状分子。这些样品和天然pBR322 DNA的W_r都直接用琼脂糖凝胶电泳加以分析和测定。作者观察到用同样的培养剂在37℃培养同一菌株所获得的不同pBR322 DNA样品,其超螺旋数值可以在相当大的范围内波动。为了便于比较不同的超螺旋DNA,作者采用了一种新的单位——超螺旋跨距,它可能有助于进一步研究环状双链DNA的本质。     

蓖麻蚕rDNA的十字结构

单链核酸酶——S1酶在超螺旋pBR322上有专一的切点。这是因为在pBR322超螺旋分子上邻近的反向重复顺序所形成的十字结构具有单链区能为S1酶作用。真核细胞基因——蓖麻蚕rDNA的完整重复单位插入pBR322所组建的质粒pARⅢ,其超螺旋分子的顺序上也有S1敏感区。用S1酶和PstⅠ酶双酶切可以产生特定长度的片段。pARⅣ是带有pARⅢEeoRⅠ(2)-BamHⅠ(2)片段的次级克隆,超螺旋pARⅣDNA经S1酶和PstⅠ酶双酶切所显示的S1酶切点与pARⅢ一致。由于对S1酶的相对敏感度不同,在pARⅢ和pARⅣ分子中原有的pBR322上的S1酶切点被掩盖。真核细胞DNA的十字结构在染色质水平上的功能意义有待进一步探讨。     

核多角体病毒感染昆虫细胞的DNA拓扑异构酶性质的研究

核多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus)的核酸是双股环状DNA,在病毒颗粒中呈超螺旋状态。超螺旋DNA复制时,一般皆有超螺旋解旋过程。为了解这一机制,本文报道了从NPV感染的家蚕中肠组织中分离细胞核,经过羟基磷灰石、磷酸纤维素柱层析,ssDNA-纤维素亲和层析,纯化了DNA拓扑异构酶I,SDS-PAGE测定分子量为47kd,最适Mg~(++)浓度约为5mM。AcNPV感染的TN368细胞DNA拓扑异构酶I总活力较正常细胞酶活力高1～3倍,且活力的提高与病毒增殖平行。讨论了昆虫细胞DNA拓扑异构酶I的性质及其与NPV复制的关系。     

酶切法鉴定质粒的亚型

商品化质粒小量抽提试剂盒制备的质粒DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测可见2条亮带,分别回收2条亮带,使用限制性内切酶分别消化,再用琼脂糖凝胶电泳检测,依据质粒的亚型(超螺旋、线性、开环)在以琼脂糖凝胶为介质的电场中的移动速度不同,鉴定出制备的质粒DNA电泳图中的2条亮带分别是超螺旋质粒和开环质粒。     

DNA双链区的切割导致碱变性超螺旋质粒pBR322的分子内结节

为进一步研究碱变性超螺旋DNA(Ⅳ型DNA;DNA Ⅳ)的结构,对碱变性质粒pBR322进行了酶学分析并利用原子力显微镜(AFM)对新形成的DNA结构进行了观察和比较．在所有已检测的限制酶中只有PstⅠ可以切割质粒pBR322的Ⅳ型DNA分子,说明在这种变性的DNA分子中仍存在少数完整的限制酶识别位点．与碱变性DNA分子的闭合环状结构相反,AFM成像的结果显示PstⅠ处理后的DNA Ⅳ分子均为开放结构,同时这种分子包含明显的DNA结节．与DNA Ⅳ分子相比,这种DNA分子的表观长度缩短了大约11%．有意思的是,大肠杆菌拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)也可以在pBR322 DNA Ⅳ分子中引入分子内结节,而这种结节DNA分子仍然保持闭合状态．AFM的结果表明上述两种结节的DNA分子在表观长度及结节结构的尺寸上均比较相似．这些发现证实,在碱变性的超螺旋DNA分子中仍然保留着一些长度较短的、含有特异性碱基配对的DNA双链区,而在这些区域内的DNA双链断裂可以导致DNA结节．     

耻垢分枝杆菌宿主整合因子(IHF)对DNA拓扑结构的影响

结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)是结核病的病原菌,每年导致数百万人死亡.对于分枝杆菌基本生物学特性的研究有助于新的药物及治疗手段的研发.耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)是分枝杆菌属中的一种非致病菌,与结核分枝杆菌亲缘关系较近,是实验室常用的研究分枝杆菌的模式菌种.分枝杆菌主要编码三种染色质蛋白,类组蛋白HU、Lsr2和宿主整合因子IHF.为研究IHF在染色体包装中的作用,我们在大肠杆菌中表达、纯化了耻垢分枝杆菌IHF蛋白(MsIHF),并对其影响DNA拓扑结构的性质进行了系统分析.体外研究的结果表明,MsIHF以同二聚体的形式存在,其对负超螺旋DNA具有一定的结合偏好性,同时,该蛋白可以有效地固定DNA负超螺旋.进一步的研究表明,MsIHF可以调控拓扑异构酶的活性.MsIHF的结合明显地抑制拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性,而与此相反,该蛋白可以轻微地促进旋转酶引入DNA负超螺旋的能力.以上结果提示,MsIHF可能通过调控拓扑异构酶的活性影响染色体DNA的结构,进而调控其包装.     

大肠杆菌topA-菌株中质粒pBR322的超凝集结构

超凝集DNA是质粒DNA的一种特殊拓扑结构形式,最初在大肠杆菌SD108(topA gyrB225)细胞中被发现.现在大肠杆菌DM800(topA-gyrB225)细胞中也发现了这种结构,这说明超凝集DNA的形成与细胞内旋转酶活性降低有直接关系,而与拓扑异构酶Ⅰ的存在与否无关.体外实验的结果显示,具有很强的正超螺旋松弛活性的拓扑异构酶Ⅳ可以将超凝集DNA完全松弛,这也证明质粒DNA的超凝集结构与超螺旋结构在细胞内是可以互变的.使用原子力显微镜对分离到的pBR322DNA超凝集结构进行分析,并与普通超螺旋进行比较,结果表明,超凝集DNA分子的结构发生了巨大的变化,其分子长度比正常超螺旋分子缩短了约30%,宽度和高度则增加了60%,结构更接近于A型DNA.另外,原子力显微镜研究结果表明,氯喹的嵌入并非改变了超凝集DNA的超螺旋状态,而是使其打结并最终压缩成一团.     

DNA超螺旋构象的理论研究

本文总结了近年来描述DNA超螺旋结构的基本关系式和各种参量,综述了计算超螺旋的几何参数,定量分析DNA分子与蛋白质结合时的特殊构象,以及基于物理模型解释和预见精确的超螺旋空间构象等方面的理论研究进展。     

新生霉素抑制拓扑异构酶Ⅱ对多瘤病毒DNA合成的影响

本文报告了Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂——新生霉素对多瘤病毒DNA合成的抑制作用,发现新生霉素对细胞和病毒DNA的体外合成具有不同的抑制曲线。新生霉素在复制过程中抑制复制中间物转变成成熟的病毒DNA分子的过程,同时影响病毒DNA分子的负超螺旋密度。本文结果提示Ⅱ型拓扑异构酶是病毒DNA复制末期所必须的酶。     

大肠杆菌topA－菌株中质粒pBR322的超凝集结构

超凝集DNA是质粒DNA的一种特殊拓扑结构形式，最初在大肠杆菌SD108 (topA⁺ gyrB225)细胞中被发现. 现在大肠杆菌DM800(topA^－ gyrB225)细胞中也发现了这种结构，这说明超凝集DNA的形成与细胞内旋转酶活性降低有直接关系，而与拓扑异构酶Ⅰ的存在与否无关. 体外实验的结果显示，具有很强的正超螺旋松弛活性的拓扑异构酶Ⅳ可以将超凝集DNA完全松弛，这也证明质粒DNA的超凝集结构与超螺旋结构在细胞内是可以互变的. 使用原子力显微镜对分离到的pBR322 DNA超凝集结构进行分析，并与普通超螺旋进行比较，结果表明，超凝集DNA分子的结构发生了巨大的变化，其分子长度比正常超螺旋分子缩短了约30%，宽度和高度则增加了60%，结构更接近于A型DNA. 另外，原子力显微镜研究结果表明，氯喹的嵌入并非改变了超凝集DNA的超螺旋状态，而是使其打结并最终压缩成一团.     

重组质粒pVAX1-PENK大规模制备研究

目的：建立质粒pVAX1-PENK的大规模制备2--艺。方法：对大肠杆菌工程菌DH5α-pVAX1-PENK进行补料发酵,利用自行发明的连续碱裂解过程对菌体进行裂解,经超滤浓缩后,用Sepharnse 6 Fast Flow层析柱分离DNA与RNA,再经Plasmidselect Xtra层析柱分离超螺旋质粒DNA与开环或线性质粒DNA,最后经Source 15Q层析柱精制质粒DNA。结果：发酵获得质粒pVAX1-PENK的产率为182mg／L,经碱裂解及层析分离后,最终制备的质粒DNA超螺旋比例大于98％,总回收率为60.5％,纯度（D260nm／D280nm）为1.8～2.0。结论：建立的质粒DNA生产工艺可以制备大量高纯度的质粒DNA,并避免了使用动物源性的酶及有毒试剂。     

极端嗜热古菌—芝田硫化叶菌反向旋转酶的快速纯化

反向旋转酶是一种I型拓扑异构酶,它可以利用ATP水解的能量向DNA分子中引入正超螺旋。通过阴离子交换层析、亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）从芝田硫化叶菌（Sulfolobus shibatae）中分离得到一种反向旋转酶。SDSPAGE 显示,该酶分子量约为126 kD,N末端序列测定结果表明,该酶为芝田硫化叶菌中一种新的反向旋转酶。     

芝田硫化叶菌ssh7a和ssh7b基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的性质

极端嗜热古菌——芝田硫化叶菌DNA结合蛋白Ssh7a和Ssh7b的编码基因(ssh7a和ssh7b)在大肠杆菌中得到表达,表达量均达到细胞蛋白总量的10%～15%。重组蛋白通过一个包括热处理步骤的简单纯化程序得到纯化。重组Ssh7a和Ssh7b与松弛及负超螺旋DNA的结合与天然Ssh7蛋白无异,与天然Ssh7相似,Ssh7a在与DNA结合时能够固定负超螺旋,每固定一个负超螺旋约需22个Ssh7a分子。这些结果表明天然Ssh7蛋白中的两个同源多肽与DNA结合时无明显差异。另外,Ssh7的甲基化与否似乎不影响该蛋白对DNA的亲和力及固定DNA超螺旋的能力。     

Nature揭示染色体复制新机制

在染色体的复制过程中，复制叉前端区域的亲代DNA分子常常会形成正超螺旋。尽管过去的研究证实为了确保复制又向前推进，常通过拓扑异构酶使DNA发生短暂的断裂从而释放出超螺旋产生的应力。还有一些科研团体则认为前进的复制又是沿着DNA螺旋发生旋转进而减少超螺旋的。然而一直以来科学家们对于在真核生物中线性染色体复制诱导的超螺旋应力的释放机制仍了解得不是很清楚。