鸡贫血病毒VP1和VP2蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与Cvn Ⅰ酶切线性化的亲本病毒Bm\|BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCCMSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生相应的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒(Recombinant BmNPV)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

摘要：【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫 细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体.首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV-VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX△E3VP2.用Sal I+Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2.Cla I+Asc I酶切pCAV-2-FPV-VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2.该重组病毒能使MDCK细胞产生腺病毒样细胞病变.Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白.该重组病毒可以有效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体.本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株.     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体。首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培 养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV- VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX △E3VP2。用Sal I Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2 全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2。Cla I Asc I酶切pCAV-2-FPV- VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2。该重组病毒能使MDCK细胞产生 腺病毒样细胞病变。Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白。该重组病毒可以有 效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体。本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株。     

猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性

将猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)vp2基因重组到杆状病毒BacToBac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastvp2质粒。在DH10Bac大肠杆菌中,pFastvp2与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组,从而获得重组穿梭载体Bacmidvp2,转染Sf9细胞得到重组病毒AcNPVvp2。SDSPAGE和Westernblotting分析可见大小约为64kD的特异性带,表明AcNPVvp2在Sf9细胞中成功地表达了PPV VP2蛋白。红细胞凝集试验和间接ELISA进一步证实,表达的VP2蛋白具有与全病毒相同的血凝活性和相似的抗原性。电镜观察VP2蛋白的粗提物,发现VP2蛋白可自行装配成许多病毒样粒子(VLPs)。     

含禽流感病毒M2e 氨基端抗原表位的重组传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的免疫原性鉴定

【目的】构建传染性法氏囊病毒VP2蛋白展示禽流感M2e抗原表位的重组蛋白,研发预防H5或H9亚型禽流感和传染性法氏囊的基因工程疫苗。【方法】根据现有禽流感疫苗株M2e的氨基端12个氨基酸多肽序列(nM2e)序列,结合GenBank中H5和H9亚型禽流感病毒nM2e的比对结果,确定nM2e序列。用融合PCR分别将1拷贝H5或H9的nM2e序列插入IBD B87株VP2基因的PBC区,获得VP2BCnM2e重组基因。将重组基因克隆至杆状病毒表达系统,转染Sf9细胞进行表达。经间接免疫荧光和Western blotting检测Sf9细胞表达重组基因后,扩繁重组病毒,制备疫苗,间隔4周对非免鸡作2次重复免疫,用间接ELISA和鸡胚成纤维细胞中的病毒血清中和试验检测血清中VP2和nM2e的抗体效价。【结果】成功构建含H5或H9 nM2e的VP2BCnM2e重组基因,该重组基因在Sf9细胞中得到表达。经免疫鸡,两重组蛋白均能激发针对VP2和nM2e的抗体,VP2BCnM2eH5组抗体效价高于VP2BCnM2eH9组。【结论】两重组蛋白均具有免疫原性,VP2BCnM2eH5免疫原性更佳。     

犬瘟热病毒抗原表位T’TB和犬细小病毒VP2蛋白的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

应用PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-VP2,将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位基因T'TB克隆至VP2基因的上游,命名为 pFastBacHTc-T'TB-VP2.进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒VP2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,将其转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70 ku.经Western blot分析,结果显示:表达的蛋白具有良好的免疫原性.表达的重组蛋白在无佐剂参与的情况下,按确定的免疫程序免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫学指标.结果表明:表达蛋白能诱导小鼠产生抗CDV和CPV的特异性中和抗体.本实验为重组犬瘟热与犬细小病毒新型亚单位疫苗的研制奠定了重要的物质基础.     

鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析

将鸡贫血病毒(CAV)VP1蛋白449个氨基酸中的424个氨基酸(占95%)编码序列分二段,分别克隆入表达性载体pGEX-5X-3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫小鼠4次,制备了抗CAV的多克隆抗体.通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验(IFA),结果为阳性.这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性.用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断.     

IL-2与猪细小病毒VP2基因双表达载体的构建及免疫原性的研究

将白细胞介素-2基因和猪细小病毒VP2基因主要抗原区克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-IL2-VP2重组质粒,用脂质体将其转染到PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCIneo-IL2-VP2重组质粒、对照组pCI-neo和猪细小病毒活疫苗通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-IL2-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-IL2-VP2质粒1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-IL2-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究

利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3.1( )分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的pCIneo VP1和含有VP2基因的pCIneo VP2与pcDNA VP2三种真核表达质粒。将上述三种真核表达质粒分别转染ＩＢＲＳ－２细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表明上述三种质粒均能在ＩＢＲＳ－２细胞表达,表达产物位于细胞中。在此基础上,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式,间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneo VP1质粒诱导的体液免疫最强,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当,pCIneo VP2诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组,pCIneo VP1和pCIneo VP2联合免疫并没有加强作用。     

水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表达及其检测应用

将构建好的重组质粒pMD-VP2a、pMD-VP2b分别经双酶切获得基因片段VP2a、VP2b,分别将其定向插入到原核表达载体pMAL-c2中,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,经IPTG诱导,两段基因均获得表达;Westernblot分析表明表达蛋白具有良好的抗原性。用KCI染色后,切胶回收的方法对表达蛋白进行纯化,以纯化的目的蛋白作为诊断抗原初步建立了水貂阿留申的VP2-CIEP诊断方法。结果表明该方法具有较高的灵敏性和特异性,与传统的CIEP方法的检出符合率达94.3%。     

猪水泡病病毒VP2基因抗原区在大肠杆菌中的表达

利用RT_PCR技术 ,以SVDVHK’70为材料 ,扩增出VP2基因抗原区。将目的基因的PCR扩增产物直接进行双酶切 ,然后将酶切产物与酶切后的表达载体pGEX 4T_1进行连接 ,转化BL2 1菌体并提质粒 ,经酶切、PCR鉴定为阳性的重组质粒命名为pGEX_VP2 ,并测序。测序结果表明 ,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确 ,表达载体构建成功。将含有阳性质粒的BL2 1菌液经IPTG诱导后进行SDS_PAGE分析 ,出现预期的目的蛋白条带 ,此目的蛋白经Westernblot检测确定其有免疫活性。     

猪水泡病病毒VPl基因抗原区的原核表达

利用RT-PCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VPl基因的抗原区,将其克隆到表达载体pProEX-HTb中,获得重组质粒,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测表明,重组菌能表达猪水泡病病毒VPl抗原区蛋白;Western blot检测表明,诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

B19病毒XA株VP1独特区真核表达系统的建立及鉴定

目的:克隆B19病毒XA株VP1u基因,构建真核重组表达载体.方法:从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体plRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u.将其转染至HeLa细胞,提取细胞总蛋白,用Western blot技术检测VP1u蛋白的表达.结果:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u,荧光显微镜下可见pIRES2-EGFP-VP1u转染HeLa细胞后表达EGFP蛋白而发出绿色荧光,Western blot证明VP1u蛋白在HeLa细胞中表达.结论:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u并在HeLa细胞中正确表达,为今后B19病毒VP1u基因疫苗的研究奠定基础.     

Production of chicken anemia virus (CAV) VP1 and VP2 protein expressed by recombinant Escherichia coli

Chicken anemia virus (CAV) is an anemia agent of breeder and young chicks. This virus is the cause of economic losses across the chicken industry worldwide as a consequence of severe anemia and immunodeficiency among the birds. Two genes of CAV encoding the VP1 and VP2 proteins were cloned and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). A Western blot assay using His-tag antiserum was used to assess the expression level of the CAV viral proteins in E. coli. The results demonstrated that only full-length VP2 can be successfully expressed in E. coli, but not full-length VP1. A serial of N-terminus deletions of the VP1 protein, VP1Nd30, VP1Nd60 and VP1 Nd129, were created using PCR in order to improve VP1 expression. The results demonstrated that all three of these recombinant VP1 mutant proteins can be expressed in E. coli. VP1Nd129 protein demonstrates the highest expression level compared to the other two proteins. The specificity of Nd129-VP1 and VP2 protein were confirmed by mass spectrometry. By comparing the expression level of VP1Nd129 and VP2 protein after the addition of IPTG, the results indicated that the VP1Nd129 protein gave a higher level of protein expression than VP2. The highest yields of VP1Nd129 and VP2 were 26.2 and 15.5 mg/L, respectively, after IPTG induction with 0.1 mM IPTG for 6 h, respectively. The identification of the optimized conditions for production of the CAV viral proteins VP1 and VP2 will allow them to be used in the future as an antigen for the development of vaccines and diagnostic tests.     

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB 基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。     

MDV-1 VP22 conjugated VP2 enhancing immune response against infectious bursal disease virus by DNA vaccination in mice

VP22 of Marek’s disease virus serotype 1 (MDV-1) could function in protein transduction. In this study, an infectious bursal disease virus VP2 gene was fused to the carboxyl termini of VP22. It showed that the fusion protein did not spread into the bystander cells from the cells transfected with pVP22-VP2, as the VP22 alone could. The VP22 proteins were found to be translocated into all the nuclei in the neighboring COS-1 cells, as analyzed by a fluorescence assay. Although mice were immunized with the recombinant DNAs mixed with polyethylenimine (PEI) at a dose of 1:2, it failed to enhance the antibody response against IBDV VP2, as measured by the indirect ELISA assay, yet the cell mediated immune response was significantly increased. The ratio of CD8 /CD4 T cells was significantly increased in the immunized group with the fusion genes, compared with the group immunized with VP2 (P<0.05). Our results demonstrated that VP22 indeed enhances the cell-mediated response in the fused VP2 in a mice model system, possibly due to the fact that the IBDV VP2 could be carried into the surrounding cells at a limited level under pressure from MDV VP22.     

鹅细小病毒和番鸭细小病毒核酸疫苗重组质粒的构建及表达

将鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MPV）主要结构蛋白（VP2－VP3）基因克隆到核酸疫苗质粒pIRESlneo载体上,构建了核酸疫苗重组质粒pIGVP1和pIMVP,通过脂质体转染法分别将重组质粒到鹅胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞中,核酸疫苗重组质粒pIGVP1和pIMVP分别转染鹅胚成纤维细胞和番鸭成纤维细胞中,于转染后72h收取细胞,细胞裂解液裂解后,经Western blot检测其表达产物可出现特异性反应带,证明表达产物具有很好的反应原性。