猪细小病毒核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫原性的研究

将猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-VP2重组质粒,转染至PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况;并以小鼠为动物模型,将pCIneo-VP2、pCI-neo重组质粒、猪细小病毒活疫苗和对照组通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-VP2质粒 1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,为研制出高效、新型猪细小病毒疫苗提供了科学依据和试验依据。     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。     

猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究

利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3.1( )分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的pCIneo VP1和含有VP2基因的pCIneo VP2与pcDNA VP2三种真核表达质粒。将上述三种真核表达质粒分别转染ＩＢＲＳ－２细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表明上述三种质粒均能在ＩＢＲＳ－２细胞表达,表达产物位于细胞中。在此基础上,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式,间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneo VP1质粒诱导的体液免疫最强,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当,pCIneo VP2诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组,pCIneo VP1和pCIneo VP2联合免疫并没有加强作用。     

犬瘟热病毒抗原表位T’TB和犬细小病毒VP2蛋白的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

应用PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-VP2,将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位基因T'TB克隆至VP2基因的上游,命名为 pFastBacHTc-T'TB-VP2.进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒VP2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,将其转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70 ku.经Western blot分析,结果显示:表达的蛋白具有良好的免疫原性.表达的重组蛋白在无佐剂参与的情况下,按确定的免疫程序免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫学指标.结果表明:表达蛋白能诱导小鼠产生抗CDV和CPV的特异性中和抗体.本实验为重组犬瘟热与犬细小病毒新型亚单位疫苗的研制奠定了重要的物质基础.     

犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用

[目的]探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性.[方法]根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠.用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平.[结果]经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化:VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%:经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDaCTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍.[结论]犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生.     

展示生长抑素的猪细小病毒样颗粒构建及其免疫原性

为了获得既可预防猪细小病毒感染又能促进生长的嵌合病毒样颗粒疫苗,以PPV NJ-a株基因组DNA为模板扩增VP2基因片段,在VP2基因N端融合人工合成的4拷贝生长抑素基因,构建杆状病毒转移载体pFast-SS4-VP2。通过转化DH10Bac感受态细胞,pFast-SS4-VP2与穿梭载体Bacmid重组,获得重组Bacmid,命名为rBacmid-SS4-VP2。rBacmid-SS4-VP2转染Sf-9细胞,获得重组病毒rBac-SS4-VP2。SDS-PAGE与Western blotting鉴定可见约68 kDa的rSS4-VP2条带;rBac-SS4-VP2感染细胞IFA检测产生很强的特异性绿色荧光;感染细胞超薄切片电镜观察到大量特征性病毒样颗粒。将重组蛋白分别辅以铝胶、IMS和白油不同佐剂免疫小鼠,通过检测免疫小鼠VP2特异性ELISA抗体、PPV特异性中和抗体、生长抑素的抗体水平及生长激素水平来评价嵌合病毒样颗粒的免疫原性。结果表明,辅以铝胶与IMS佐剂重组蛋白组均产生了与PPV全毒组相似的ELISA抗体与中和抗体反应;重组蛋白免疫组均产生较好的针对生长抑素的抗体反应;免疫小鼠体内生长激素的水平明显升高;其中以铝胶佐剂组产生的各抗体水平最高,白油佐剂组各抗体水平最低。为以后生产安全、有效的颗粒化亚单位疫苗提供了一个新的设计思路,又为应用病毒样颗粒递呈外源肽,从而生产多联亚单位疫苗奠定了基础。     

犬细小病毒VP2亲水性编码区的表达与免疫原性分析

目的：探讨犬细小病毒VP2亲水性编码区的免疫原性,为进一步研究基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法：利用蛋白质分析软件Protean对已克隆的犬细小病毒VP2基因序列进行分析,选择亲水性好、抗原性强的293-520位氨基酸区域（命名为VP2S）作为靶序列,然后以已有VP2序列作为模版通过PCR扩增的方法获得VP2S,将VP2S克隆入pQE-31载体获得pQE-31-VP2S;将pQE-31-VP2S的原核表达产物经Western-blotting确认后免疫小鼠,用血凝抑制试验测定抗体水平。结果：293～520位氨基酸区域的亲水性好、抗原性强;重组质粒pQE-31-VP2S可成功表达大约29KDa的能被CPV抗血清识别的VP2S;VP2S能诱导小鼠产生高滴度的血凝抑制（HI）抗体（25）。结论：VP2S具有较强的免疫原性,能作为基因工程亚单位疫苗进行开发研究。     

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究

根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHI位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK-VP2.采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ 株的基因组DNA与pUSK-VP2共转染PK-15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPV VP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP 2株,Southern blotting、SDS-PAGE、Western blotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验.结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ 亲本株的基因组中,并获得了表达.表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒.同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当.     

共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性

【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

HIV-2 gag-gp105嵌合基因DNA疫苗对小鼠的免疫原性研究

利用真核表达载体 pVAX1 构建 HIV-2 gag-gp105 嵌合基因的重组质粒 pVAX1gag-gp105,将其转入 BHK21细胞中,利用间接免疫荧光方法检测其表达情况。进一步分别将核酸疫苗质粒 pVAX1gag-gp105、对照组质粒pVAX1 和 PBS 溶液经肌肉注射免疫 BALB/c 小鼠,检测免疫小鼠脾 CD4 、CD8 T 细胞亚群的数量,脾特异性 CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,重组核酸疫苗质粒 pVAX1gag-gp105 疫组小鼠脾 CD4 、CD8 T 细胞亚群的数值均比对照组高( P<0.01),脾特异性 CTL 杀伤活性与对照组相比差异极显著(P<0.01),血清抗体滴度显著高于对照组(P<0.01) 。以上结果表明,HIV-2 gag-gp105 嵌合基因 DNA 疫苗对 BALB/c 小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性。     

含分子内佐剂的SARS-CoV-2 RBD域重组蛋白制备及免疫效果评价北大核心CSCD

制备含破伤风毒素肽(tetanus toxin,TT)、促吞噬肽(tuftsin)和新型冠状病毒刺突蛋白(spike,S蛋白)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的融合蛋白,探讨分子内佐剂对RBD蛋白体液免疫和细胞免疫效果的影响。将破伤风毒素肽、促吞噬肽与S蛋白RBD区域通过柔性多肽串联,密码子优化后构建重组载体,原核表达纯化制备重组S-TT-tuftsin蛋白,与铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠,对其体液及细胞免疫效果进行评价。重组S-TT-tuftsin蛋白以包涵体形式表达,离子交换层析纯化后采用梯度透析进行复性,复性蛋白经Dot blotting鉴定,可与新冠亚单位疫苗(安徽智飞公司)免疫后人血清发生反应。小鼠免疫实验结果表明,免疫35 d时抗体水平到达平台期,含分子内佐剂重组蛋白(铝佐剂)免疫小鼠后血清ELISA抗体效价高达1︰66240,显著高于S-RBD蛋白(铝佐剂)免疫小鼠抗体效价(P<0.05)。同时,含分子内佐剂重组蛋白刺激小鼠产生更强的淋巴细胞增殖能力,刺激指数可达4.71±0.15,相较于S-RBD蛋白的刺激指数1.83±0.09具有显著性差异(P<0.0001)。分子内佐剂破伤风毒素肽和促吞噬肽可显著增强新冠S蛋白RBD域的体液免疫和细胞免疫效果,可为新冠亚单位疫苗和其他病毒亚单位疫苗的研制提供理论基础和参考。     

免疫共刺激分子OX40L对乙型肝炎核酸疫苗的免疫佐剂作用

[目的]为了进一步增强HBV DNA疫苗的免疫反应,本研究将共刺激分子OX40L 作为HBV DNA疫苗的分子佐剂免疫小鼠,旨在探讨共刺激分子OX40L对HBV DNA疫苗诱导体液和细胞免疫应答的影响.[方法]我们将HBV DNA疫苗(pcDS2)单独或联合共刺激分子质粒pOX40L免疫C57BL/6小鼠;分别在第0,2,4周进行免疫,在第6周检测抗-HBs IgG、IgG1和IgG2a,T淋巴细胞增殖指数,细胞因子表达水平和体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL)等免疫学指标.[结果]pceDS2联合pOX40L免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高,抗-HBs IgG亚类以IgG2a占优;免疫小鼠的T淋巴细胞体外经乙型肝炎表面抗原(HBsAg)刺激后,联合免疫组刺激指数(SI)明显高于pcDS2组;联合免疫组CD4 + T淋巴细胞的IL-4和IFN-γ表达水平及CD8 + T淋巴细胞的IFN-γ表达水平显著升高;DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBsAg特异性体内CTL高于对照组,其中联合免疫组小鼠的体内CTL杀伤作用最强.[结论]共刺激分子OX40L不仅能增强HBV DNA疫苗诱导特异性体液免疫应答,还能增强特异性细胞免疫反应,尤其增强体内CTL的杀伤活性,为HBV DNA疫苗的研究奠定了基础.     

禽IL-2与传染性法氏囊VP2融合蛋白免疫学特性

为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性,将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡,通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(γ-IFN)和Th2(IL-4)类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85%的保护率,表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。     

乙肝病毒DNA疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

构建含adr亚型HBV表面抗原基因的核酸疫苗 ,考察人白细胞介素II基因及重组白细胞介素II的免疫佐剂作用。用含有人白细胞介素II基因的真核表达质粒及基因重组白细胞介素II蛋白作为佐剂 ,将编码乙型肝炎病毒表面抗原的重组真核表达质粒 pVAX/HBS免疫BALB/C小鼠 (试验组 ) ,同时设置注射质粒pVAX的阴性对照组 ,并分别于第 2 ,4周后加强免疫各 1次。试验组在第 4周时开始有HBsAb产生 ,阴性对照组未测到HbsAb ,试验组和对照组均未检测到HBsAg。乙肝病毒DNA疫苗能引起小鼠特异性体液免疫应答 ,白细胞介素II的真核表达质粒的佐剂作用不明显 ,基因重组白细胞介素II蛋白具有提高小鼠对乙肝病毒核酸疫苗免疫应答水平的佐剂活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白实验性核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)长春分离株ORF5基因,并将其克隆至真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒。通过Western blot以及IFA检测方法确认,所构建的2个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5)。同时辅以不同佐剂进行了BALB/c小鼠免疫试验,检测了免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量。结果表明:共表达猪IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量均优于pVAX1-ORF5,而且加佐剂实验组优于未加佐剂的实验组。     

Comparison of cholera toxin A2/B and murine interleukin-12 as adjuvants of Toxoplasma multi-antigenic SAG1-ROP2 DNA vaccine

Toxoplasmosis can lead to severe pathology in both humans and animals. However, an effective vaccine for humans has not been successfully developed. In this study, we used multi-antigenic SAG1-ROP2 as a DNA vaccine and cholera toxin A2/B subunit and murine interleukin-12 to compare their effectiveness as genetic adjuvants. Bagg albino/c (BAL/c) mice were immunized intramuscularly with pcDNA3.1-SAG1-ROP2 alone (control group), or pcDNA3.1-SAG1-ROP2 with co-administration of pCTA2/B or pIL-12, respectively. After immunization, the effectiveness of these two adjuvants were compared using lymphocyte proliferation assay, cytokine and antibody measurements. The group co-administered pIL-12 elicited stronger humoral and Th1-type cellular immune responses than those immunized with pcDNA3.1-SAG1-ROP2 alone, while in the group co-administered pCTA2/B there was no obvious enhancement of immunity. When challenged with Toxoplasma gondii RH strain, mice immunized with pIL-12 co-administration had significantly higher survival rates, whereas there was no notable augmentation of immunity in pCTA2/B group. Therefore, since pIL-12 significantly enhanced the antigenicity of multi-antigenic DNA vaccine, this suggests that IL-12 is a better and more effective adjuvant than CTA2/B in this situation.     

新型呼肠病毒 S基因 DNA 疫苗在小鼠体内的免疫原性

目的：探讨新型呼肠病毒R4株S片段免疫小鼠后引发的免疫应答。方法构建4个不同S基因节段的重组真核表达质粒,并免疫小鼠;ELISA检测血清以研究R4特异性抗体升高水平,并对其抗体亚型进行鉴定;ELISPOT检测小鼠淋巴细胞INF-γ的表达情况。结果与对照组相比,4个重组质粒免疫的小鼠血清都有明显的R4特异性抗体升高,尤其以S1和S3基因免疫后抗体水平较高,且均以IgG2a占绝对优势;S1基因免疫组小鼠的细胞免疫应答最强。结论 S1基因重组质粒免疫小鼠后可同时引发较强的体液免疫和细胞免疫应答,是较为理想的疫苗备选基因片段。