华东地区家鸭中N1亚型禽流感病毒NA基因的遗传进化分析

为了解华东地区家鸭内禽流感病毒的遗传进化情况,对2002~2006年分离自华东地区家鸭的3种主要N1亚型的禽流感病毒:2株H1N1、10株H3N1和14株H5N1,共26株病毒的NA基因进行了遗传进化分析。结果表明,华东地区家鸭中的N1亚型的禽流感病毒正处于不断进化状态中。14株H5N1禽流感病毒均在NA的茎部缺失20个氨基酸(49~68位),而其他N1亚型的禽流感病毒的NA都未见发生此缺失。H3N1病毒可能与H1N1病毒发生了NA基因的重排,但是目前还没有直接证据表明华东地区家鸭中H5N1禽流感参与了基因重排。     

一株水禽流感病毒分离株表面膜蛋白基因的序列分析

禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒所引起的各种家禽及野生禽类感染和/或疾病综合征[1].根据其表面糖蛋白血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨基酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原关系不同,目前可分为16种HA亚型和9种NA亚型[2,3].近几年来,南亚国家屡有禽流感病毒突破种间屏障作用,直接感染人类或其它哺乳动物,甚至致人死亡事件[4～6]的情况发生,因而赋予了禽流感全新的公共卫生学意义.因此,准确的了解和把握水禽,尤其是家养水禽的流感生态,对预防禽流感的发生具有非常重要的现实意义.为了防患于未然,近年来扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室,对我国华东地区的家养水禽带毒情况进行了两年多的监测,分离到多株H11亚型,迄今国内极少见该亚型报道.本文就国内家养水禽中分离株Dk/YZ/44/02(H11N2)的表面膜蛋白基因序列进行了测序和序列分析.     

A型禽流感病毒M2e重组T7噬菌体疫苗构建及免疫原性研究

构建展示A型禽流感病毒M2e多肽的重组T7噬菌体,检测其对SPF鸡的免疫保护效果。比对GenBank近期发表的A型禽流感病毒M2e基因序列进行人工合成并重复至两拷贝,将其克隆到T7Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-M2e。经PCR鉴定并序列测定筛选阳性重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernblot检测重组噬菌体表面M2e多肽。重组噬菌体以1×1010pfu/只剂量免疫SPF鸡,免疫后不同时间段采血通过ELSIA检测血清中抗M2e抗体,免疫荧光检测血清抗体与H9亚型禽流感病毒的结合能力,并以200个EID50/只剂量进行攻毒保护效率检测。成功构建重组噬菌体T7-M2e,插入两拷贝M2e基因获得表面展示,并与M2e抗体有免疫反应活性。噬菌体疫苗免疫后均产生抗M2e抗体,其抗血清能跟病毒粒子特异性结合,攻毒保护率达4/5(80%)。获得了展示禽流感病毒M2e多肽的重组噬菌体,噬菌体疫苗免疫鸡产生较高血清抗体并提供攻毒保护,为新型通用禽流感疫苗研制提供新思路。     

混合感染的多种亚型禽流感病毒的纯化与鉴定

【目的】研究混合感染的多种亚型禽流感病毒的纯化和鉴定方法。【方法】用鸡胚终点稀释法和鸡胚终点稀释法结合特异性血清中和法分别对2-3种已知亚型禽流感病毒的混合感染样品进行纯化,并对纯化结果用RT-PCR和血凝抑制试验进行鉴定。用建立的方法对214份禽流感病毒阳性样品进行了纯化和鉴定。【结果】用鸡胚终点稀释法对样品稀释、传代6-7次可使病毒达到纯化,但用鸡胚终点稀释法结合特异性血清中和法对样品稀释、传代4-5次即可达到病毒纯化。用RT-PCR和血凝抑制试验两种方法同时鉴定病毒的纯化效果,可明显提高准确性。用本方法从214份样品中纯化出涵盖13种亚型的禽流感病毒233株。【结论】鸡胚终点稀释法及其结合特异性血清中和法均能对禽流感病毒进行纯化,但是鸡胚终点稀释法结合特异性血清中和法更具有针对性,也更有效。另外,对纯化结果的鉴定需采取多种手段。     

一株水禽流感病毒分离株表面膜蛋白基因的序列分析

禽流感(AvianInfluenza,AI)是由A型流感病毒所引起的各种家禽及野生禽类感染和/或疾病综合征[1]。根据其表面糖蛋白血凝素蛋白(Hemag glutinin,HA)和神经氨基酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原关系不同,目前可分为16种HA亚型和9种NA亚型[2,3]。近几年来,南亚国家屡有禽流感病毒突破种间屏障作用,直接感染人类或其它哺乳动物,甚至致人死亡事件[4～6]的情况发生,因而赋予了禽流感全新的公共卫生学意义。因此,准确的了解和把握水禽,尤其是家养水禽的流感生态,对预防禽流感的发生具有非常重要的现实意义。为了防患于未然,近年来扬州大学农业…     

H5N1亚型禽流感病毒基因重排后毒力的变化

[目的]为了探讨高致病性禽流感病毒对水禽致病性差异的分子致病机理.[方法]我们对从野鸭分离到的H5N1亚型禽流感病毒的生物学特性进行鉴定,其中A/mallard/Huadong/Y/2003(Y)是对麻鸭无致病性病毒,而 A/mallard/Huadong/S/2005(S)是对麻鸭高致病性病毒.利用反向遗传技术构建一系列单个和多个基因组合替换基因重排病毒,并验证重排病毒在麻鸭上的致病力.[结果]研究表明,PB2, PB1, PA(3P), HA单基因以及3P基因组合替换的使S病毒对麻鸭的毒力完全致弱,但相应的基因替换后仅使Y病毒对麻鸭的毒力略有上升.两病毒的其它基因对毒力影响较小.[结论]H5N1亚型禽流感病毒对麻鸭的致病力受多基因调控,且这种调控作用在不同病毒骨架上的影响不一致,强毒受影响程度远比弱毒的大.     

含禽流感病毒M2e 氨基端抗原表位的重组传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的免疫原性鉴定

【目的】构建传染性法氏囊病毒VP2蛋白展示禽流感M2e抗原表位的重组蛋白,研发预防H5或H9亚型禽流感和传染性法氏囊的基因工程疫苗。【方法】根据现有禽流感疫苗株M2e的氨基端12个氨基酸多肽序列(nM2e)序列,结合GenBank中H5和H9亚型禽流感病毒nM2e的比对结果,确定nM2e序列。用融合PCR分别将1拷贝H5或H9的nM2e序列插入IBD B87株VP2基因的PBC区,获得VP2BCnM2e重组基因。将重组基因克隆至杆状病毒表达系统,转染Sf9细胞进行表达。经间接免疫荧光和Western blotting检测Sf9细胞表达重组基因后,扩繁重组病毒,制备疫苗,间隔4周对非免鸡作2次重复免疫,用间接ELISA和鸡胚成纤维细胞中的病毒血清中和试验检测血清中VP2和nM2e的抗体效价。【结果】成功构建含H5或H9 nM2e的VP2BCnM2e重组基因,该重组基因在Sf9细胞中得到表达。经免疫鸡,两重组蛋白均能激发针对VP2和nM2e的抗体,VP2BCnM2eH5组抗体效价高于VP2BCnM2eH9组。【结论】两重组蛋白均具有免疫原性,VP2BCnM2eH5免疫原性更佳。     

水禽流感病毒分离株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)膜蛋白基因遗传进化分析

采用常规的血清学收验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行两年多的监测,分离鉴定出多株H6亚型禽流感病毒。对其中的一株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)(简称DkYZ23302)(H6N2)的表面膜蛋白基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其它序列进行了比较,遗传进化结果表明DkYZ23302的血凝素基因(HA)与近年香港分离的鸭源毒株DkHK346199(H6N1)、中国台湾鸡源毒株CkTaiwanna398的亲缘关系最近;而神经氨酸酶基因(NA)遗传进化分析结果表明DkYZ23302(H6N2)的NA基因起源于禽源H9N2亚型流感病毒,这可能是不同亚型禽流感病毒在水禽体内发生基因重配的结果。DkYZ23302(H6N2)的HA推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-D,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,与对SPF鸡的致病力试验相吻合。     

HA基因322位和329位氨基酸对H5N1亚型禽流感病毒毒力的影响

A/mallard/Huadong/S/2005(S,IVPI=2.65)和A/mallard/Huadong/Y/2003(Y,IVPI=O),是对麻鸭具有不同致病力的病毒.两病毒的HA裂解位点区有2个氨基酸差异,S病毒在HA裂解位点区322是Leu(L322),329位缺失(-329),而Y病毒322位是Gin(Q 322),329位是Lys(K329).根据这两个位点的差异,利用反向遗传系统,以S和Y病毒各自为骨架,拯救HA基因突变病毒,检测获救的突变病毒对麻鸭的毒力.可以得知,以S病毒为骨架,将S病毒HA基因322位Leu替换为Gln和(或)在329位添加Lys,以及用Y病毒的HA(Q322L,K329-)替换S病毒HA,获救的重组病毒对麻鸭亦完全无致病力;但以Y病毒为骨架,将Y病毒HA基因322位Gln替换为Leu和(或)在329位缺失Lys后,Y重组病毒对麻鸭的毒力上升.结果提示,S和Y病毒HA基因裂解位点区322和329氨基酸残基突变或缺失均影响病毒对麻鸭的致病力,且HA基因与其它基因的匹配性显著影响病毒对麻鸭的致病力.