杆状病毒DNA解旋酶

ＤＮＡ解旋酶 (ｈｅｌｉｃａｓｅ)是ＤＮＡ复制过程中一类重要的酶 ,负责打开ＤＮＡ双链 ,并参与新生链的合成 ,在ＤＮＡ修复和重组过程中都发挥着必不可少的作用。杆状病毒ＤＮＡ解旋酶除了参与ＤＮＡ复制外 ,对于晚期基因的转录、关闭宿主蛋白质合成及决定杆状病毒宿主域方面都有重要的作用。1.杆状病毒解旋酶的结构目前已有 5种杆状病毒的ＤＮＡ解旋酶基因得到克隆并测序 ,分别是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(ＡｃＭＮＰＶ) ,黄杉毒蛾核多角体病毒 (ＯｐＭＮＰＶ) ,家蚕核多角体病毒 (ＢｍＮＰＶ) ,甜菜夜蛾核多角体病毒(ＳｅＭＮＰＶ)及粉…     

昆虫保幼激素促进家蚕杆状病毒系统的基因表达

杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression VecterSvstem,BEVS)的一个最大优点是外源基因的高效表达(Hy-perexpression).但是,不同的外源基因在BEVS系统中的表达水平相差很大,较低的如α-干扰素,表达量为1～5mg/L培养细胞;高的如β-半乳糖苷酶,表达量可达600mg/L培养细胞.外源基因在BEVS系统中表达量受到诸多因素的影响,如细胞的类型与质量,外源基因蛋白的性质,启动子序列的完整性,是否为融合蛋白等[1].如何使外源基因在BEVS系统中高效表达,是近年来该领域中研究最活跃的方向之一.已证实家蚕杆状病毒的表达量受宿主遗传型的影响,最低和最高的遗传型相差达7倍以上[2].林水中等发现家蚕饲料中添食适当浓度的硫酸铜可提高外源基因单位表达量10%左右[3].杆状病毒在复制循环中表现出两种类型:芽生病毒和包涵体病毒,其中芽生病毒引起宿主体内不同组织间的感染,包涵体病毒则引起宿主之间感染[1].杆状病毒基因组中蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(egt)基因影响激素在宿主体内的平衡[4],egt基因通过糖基化作用使蜕皮激素失活,打破宿主体内的激素平衡,延长幼虫期,以利于病毒的增殖[5].家蚕血淋巴中保幼激素(Juvenile hormone,JH)的滴度同样决定着幼虫发育的进程[6],本文通过体表使用保幼激素,以研究保幼激素对家蚕核型多角体病毒和宿主之间的相互关系及对外源基因表达量的影响.     

融合gp67信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内表达*

用AcMNPV的gp67信号肽与慈菇蛋白酶抑制剂基因(API₂)融合,并整合到昆虫病毒表达载体Bm—BacPAK6中,受多角体蛋白基因启动子控制。慈菇蛋白酶抑制剂在蚕体内成功地得到了高教表达。比较了gp67信号肽和慈菇蛋白酶抑制剂信号肽在昆虫表达系统中对表达产物的影响,发现表达产物都能分泌到血淋巴中,表达量很相似,但这两种信号肽在表达过程中都没有被切除,且不同信号肽对表达产物的生物活性有很大影响。     

饲料中维生素和无机盐对rBmNPV-Bm表达系统植酸酶基因表达活性的影响

【目的】为查明宿主的营养对重组家蚕杆状病毒-家蚕表达系统(rBmNPV-Bm)外源基因表达活性的影响,探寻提高家蚕Bombyx mori生物反应器产率的新途径。【方法】以家蚕BmNPV病毒为表达载体,以人工饲料饲养的5龄家蚕为宿主,以植酸酶基因为报告基因,探讨了家蚕人工饲料中维生素和无机盐对外源基因表达产物活性的影响。【结果】家蚕血淋巴中外源植酸酶的活性随着饲料中维生素和无机盐添加量的不同而发生显著变化。在本试验设区范围内,当维生素C的含量为饲料干物质量的1 %,B族维生素混合物为0.25 %,无机盐混合物为1 %,维生素B6为100 g饲料干物中含2 mg时,血淋巴中植酸酶活性达到最大值。【结论】通过改变家蚕饲料中微量营养成分的含量是提高rBmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的有效途径。     

猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达

为研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus PEDV)S基因片段的原核表达产物是否具有抗原性,分析S基因抗原位点后,用PCR技术扩增S蛋白主要抗原区的核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,成功构建了重组质粒pET-28a-PEDV-Sp,其重组菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h后进行SDS-PAGE分析,在分子质量约为29 kDa处出现一新蛋白带,与预期相符。质谱鉴定表明,已成功表达了目的蛋白。纯化后的重组蛋白免疫兔制备多克隆抗体,抗体效价检测结果显示该蛋白具有良好的抗原性。该研究为猪流行性腹泻基因工程疫苗的研制奠定基础。     

蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基Ⅲ的序列及其分子进化分析

测定了蓖麻蚕Samia cynthia ricini线粒体基因组(mtDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(COX3)、tRNA-Gly和部分的NADH亚基Ⅲ(ND3)基因的DNA片段序列。COX3基因编码框包含789个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。通过同源性比较,发现COX3基因的3′端比5′端要保守,其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在。COX3的下游为66 bp的tRNA-Gly基因。蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是80.2%和85.6%。根据COX3氨基酸序列进行了12种无脊椎动物的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应该综合考虑物种的繁殖模式及生态特点。     

鸡κ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测

干扰素（interferon,IFN）是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定。用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞（CEF）的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上。高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据。     

植酸酶基因在家蚕－杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillus niger 963克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫－杆状病毒表达系统中表达,SDSPAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到1.43 g/L血淋巴液和1.90 g/L血淋巴液。酶活性测定结果表明,在蚕体和蛹的表达活性分别为4.67×10⁸u/L血淋巴液和5.99×10⁸u/L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为50～60 ℃,最适pH值为5.5～5.0和2.5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性,可以用于生产饲用植酸酶。     

铁蛋白与口蹄疫病毒VP1在大肠杆菌中融合表达及纳米颗粒自组装

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的世界上最重要的畜牧疾病之一,严重影响世界畜牧业的发展,而疫苗免疫仍然是对疫情预防和控制的最有效手段。铁蛋白具有自组装和生物修饰的特性,在纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景。选用O型口蹄疫病毒的vp1基因和幽门螺杆菌铁蛋白基因,通过融合PCR将vp1基因构建到铁蛋白亚基基因前端,在大肠杆菌中表达后通过His标签进行镍柱亲和层析纯化。将纯化好的重组蛋白进行Western blotting检测、质谱分析和透射电镜观察,发现重组蛋白VP1-Ferritin在大肠杆菌中获得表达,并可自组装成纳米颗粒。