产环氧化物水解酶的黑曲霉菌种分离和发酵条件的研究*

从土壤中筛选出一株能将苯基环氧乙烷立体选择性水解为R-苯基乙二醇的环氧化物水解酶的黑曲霉SQ-6。对其产酶发酵条件进行了研究,最佳碳、氮源分别为2.0%蔗糖和2.0%玉米浆,最适初始pH为4.0,该酶不需诱导,同时还研究了其他发酵条件对产酶的影响。使用含酶细胞进行底物苯基环氧乙烷转化,产物(R)-苯基乙二醇转化率为41%,ee值为99%。     

2-氧代-4-苯基丁酸乙酯还原酶产生菌筛选及产酶条件

研究了利用生物催化不对称还原的方法制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]。以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)为底物,通过对实验室保藏菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株G2ndida krusei SW2026,并对其发酵产酶条件进行研究。其最适的发酵培养基组成为4.5%葡萄糖,3%蛋白胨,1.5%牛肉膏,0.05%Mn~(2+);适宜的产酶发酵条件为初始pH 6.0,温度28℃,摇床转速180 r/min,发酵周期48 h。将此条件下发酵培养的菌体用于OPBE的不对称还原反应,产物(R)-HPBE的对映体过量值(e.e.)可达97.33%,产率最高达到72.54%。     

手性苯基环氧乙烷的生物不对称合成

以苯乙烯为唯一碳源和能源,从不同来源的土壤样品中初筛分离出12株好氧细菌和2株真菌,经复筛,对液体培养物进行手性气相色谱分析,得到一株产生手性苯基环氧乙烷活力较高的菌种PS-1206,并对其发酵、产酶及苯乙烯的全细胞转化进行了研究,利用微生物细胞在30℃,pH 7.0,10mmol/L磷酸缓冲液中转化0.5%苯乙烯10h,获得?苯基环氧乙烷,e.e%值为80%,转化产率为35%。     

伴有辅酶原位再生的胞外酶耦合法制备（R）-苯基乙二醇

经5轮诱变筛选,从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CICC1676）中分离得到产NADH依赖型羰基还原酶（Carbonyl reductase,CR）菌株CP-9。所产羰基还原酶（CRCp-9）经两步快速纯化获得纯化倍数为11．5倍,比活力为1．84 U/mg的酶液,其还原反应的最适pH值为6．5,最适温度为40℃。该酶转化β-羟基苯乙酮制备手性化合物（R）-苯基乙二醇,因此是（R）-专一性羰基还原酶。该酶与NADH普适性再生酶-甲酸脱氢酶（For-mate dehydrogenase,FDH）在胞外相耦联,构建伴有辅酶再生与反复利用的CR/FDH双酶催化制备立体醇体系,底物β-羟基苯乙酮转化率达95．4％,产物（R）-苯基乙二醇得率为93％,辅酶的总转化数（Total turn number, TTN）达267,产物e．e．值为98．6％,批次耦合反应生产能力达0．8 g/L/h,较单酶催化有较大提高,与细胞转化法相比也具有较好的生产能力。因此,伴有辅酶再生的胞外酶耦合催化具有潜在的制备手性醇化合物的工业应用价值。     

固态发酵生产腺苷酸脱氨酶

对多株曲霉产腺苷酸脱氨酶的性能进行了比较,发现米曲霉3.800(Aspergillus oryzae)产酶水平较高。该菌株固态发酵产酶的适宜培养基为：以麸皮为主原料,蔗糖2％,鱼粉2％,（NH4）2SO4 0．1％,柠檬酸钠0．2％,MgSO4 0.05%,吐温－80 0．1％,含水量50％。最佳的培养条件为：250mL三角瓶装20g培养基,在28－30℃培养60h。在优化条件下,培养物酶活可达到1543．48u/g鲜曲。     

微生物酶拆分方法生产D-泛酸的手性中间体D-泛解酸内酯

筛选到一株产D－泛解酸内酯水解酶的串珠镰孢霉菌（Fusarium moniliforme SW-902)。产酶条件研究表明,用甘油作碳源,蛋白胨作氮源,初始pH8.0,温度26℃,摇瓶培养3d,产酶量最高。在60L和1000L发酵罐中通风发酵45－47h,产酶量为6－8g干菌体／L,D－泛解酸内酯水解酶酶活力达到0．87－0．92IU／g干菌体。该酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为7．0－7．5。在酶不对称水解泛解酸内酯过程中,对溶液加酶量5％－10％,底物浓度10％－20％,控制水解率20％－30％,水解效果最好。     

少孢根霉发酵生产超氧化物歧化酶的研究

本文研究了少孢根霉RT－3固态发酵生产SOD的条件。结果表明该菌发酵培养基的优化组成为：大豆,麸皮5％,硫酸氢0．3％,磷酸二氢钠0．03％,硫酸铜0,04％。培养基经代化后,每克培养物SOD酶活提高53％。适宜的乳酸加入量为1％。吐温－80、醋酸钠和抗坏血酸对菌体产酶没有作用。     

碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究

从儿童食品中分离筛选到1株产碱性普鲁兰酶活性较高的菌株,编号为SX－12,初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.,研究了SX－12原生质体制备与再生最佳条件,其原生质体经紫外线诱变处理,选育出产碱性普鲁兰酶的高产菌株SX－12C67,酶活由出发菌株的2．42U/mL提高到6．87U／mL,提高了约1．8倍,在此基础上对产酶条件进行了优化,优化后的最佳发酵培养基为：可溶性淀粉3％,蛋白胨1．0％,酵母膏0．5％,K2HPO42％,MgSO4.7H2O0.05%MnCl20.0001%,最适p;H9.5,最适温度40℃,初步研究了酶的部分性质,酶反应的最适pH,温度分别为10．0－10．5和55℃,在55摄氏度反应条件下,酶在pH6.0-11.0的范围内都具有一定的活性,Ca^2 ,Mn^2 ,Mg^2 等离子是酶的激活性,Zn^2 ,Hg^2 等离子是抑制剂。     

嗜碱芽孢杆菌XE22—4—1碱性弹性蛋白酶发酵条件的研究

从西藏天然碱湖中筛选到一株产碱性弹性蛋白酶（alkaline elastase)菌株,最适生长pH为10．0,经鉴定为Bacillus sp.,编号XE22－4－1.该菌产酶最适碳源为2％葡萄糖,氮源为0．25％酵母粉,豆饼粉对发酵产酶有促进作用。2L发酵罐实验表明,溶解氧是影响该菌株产酶的重要因素。通过提高通气量和改变搅拌速度,该菌株可在发酵48h内达到产酶高峰,酶活力最高达266u/mL。     

Aspergillus sp.脂肪酶发酵条件优化及酶学性质的研究

作者为了得到一种热稳定性较好的脂肪酶新酶种,通过研究分离白极端环境的Aspergillus sp．的最佳产酶条件及其所产脂肪酶的酶学性质,得出了该菌产酶的最佳发酵条件为：以1％黄豆饼粉为氮源、0．2％玉米淀粉为碳源,1．5％橄榄油为诱导物,起始pH6．0左右。装量10mL（250mL三角瓶。摇瓶转速180r／min）、发酵时间为96h。在最佳发酵条件下可得最大发酵酶活36U/mL。Aspergillus sp．所产的脂肪酶的酶学性质是：最适pH为9．0,在pH5．0—10．0于20℃下放置24h后,残余酶活仍保持在起始酶活的90％以上;该酶的最适温度为50℃,50℃保温60min后仍保留70％以上的酶活。Aspergillus sp．所产脂肪酶的热稳定性较好。     

羰基还原酶产生菌Candida ontarioensis制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇

从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。     

啤酒酵母胞外多糖发酵条件的研究

以啤酒酵母S－12为出发菌株,用紫外线＋氯化锂作为复合诱变剂,获得一株产胞外多糖量较高的变株S－12－4,比出发菌株提高33．3％,同时对变株进行了最佳培养条件的研究,结果表明：最适碳源和氮源分别为大米糖3％、酵母粉0．37％及NH4Cl0．32％,最适发酵条件为起始PH6．0、培养温度26℃,发酵周期为30h,在此基础上进行培养,变株S－12－4产胞外多糖最高可达38.2mg/100mL,比初始条件提高了54％。     

高产超氧化物歧化酶菌株发酵条件的研究

从1348株芽孢杆菌(Bacillus cereus)中分离和选育出高产超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)菌株C328,并进行了产酶条件的研究。结果表明,该菌株最佳产酶的最适温度为30～35℃,培养基最适起始pH为8．0～8．5。金属离子Cd^2 、Mn^2 、Zn^2 ,表面活性剂吐温80、司班80、琥珀酸钠和无机盐CaCl2、CaCO3对产酶有抑制作用。适宜浓度的K2HPO4、EDTA、金属离子Fe^3 和表面活性剂NaAC对产酶有明显的促进作用。发酵培养用250mL三角瓶以30mL装液量酶活力最高。适宜种龄为8～12h,适宜接种量为0．9％～3％,最佳接种量为1％～2％。     

聚半乳糖醛酸酶高产菌的产酶条件研究

通过单因素及正交试验对米曲霉（Aspergillus orza）C491产生聚半乳糖醛酸酶的发酵条件进行了优化。该菌株的摇床发酵滤液以桔子果胶为底物时酶活力可达344．8U／mL。产酶最适培养基组成为：麦芽汁（糖度6％）中添加6％桔皮粉,2％硫酸铵（w/v）。最适培养条件：起始pH4（灭菌前）,30℃,r/min,培养112h。Tween80可以促进C－491产酶。     

响应面法优化有机溶剂极端耐受性菌株Burkholderia sp．ZYB002产脂肪酶条件

Burkholderia sp．脂肪酶具有较高的有机溶剂耐受性和转酯活性,广泛应用于手性化合物的拆分。本研究利用统计学方法对一株具有有机溶剂极端耐受性的脂肪酶高产茵株Burkholderia sp．ZYB002在摇瓶培养条件下产脂肪酶条件进行了优化。通过单因素实验,首先确定了最适碳源、氮源、诱导荆等。以Plackett—Burrman设计筛选影响Burkholderia sp．ZYB002产酶的主要因素,通过最陡爬坡实验和响应面分析法确定产酶最适条件。K2HP04、大豆油乳化液和起始RH确定为影响菌株产酶的3个主效因素。最佳产酶条件为：糊精0．3％（W／V）,牛肉膏2．0％（W／V）,MgSO4．7H2O．075％（W／V）,K2HPO4 0．14％（W／V）,大豆油乳化液4．89％（V／V）,pH8．11,玻璃珠10颗／瓶,接种量2．0％（V／V）,30℃,250r／min,发酵时间22h。在此条件下,发酵液脂肪酶酶活最高达45．6U／mL,较发酵基本培养基发酵液的脂肪酶酶活提高了3．44倍。     

酵母菌产麦角固醇发酵条件的研究

为了提高酵母菌麦角固醇的产量,采用摇瓶培养法,对筛选出的一株酵母菌YN2产麦角固醇发酵条件进行了研究。结果表明,酵母菌YN2产麦角固醇适宜的培养基配方为：酵母粉1％,牛肉膏2．5％,葡萄糖8％,K2HPO4 0．3％,MgSO4 0．15％,该菌株产麦角固醇最适培养条件为：培养温度28℃,起始pH6．5,发酵时间72h。在优化的实验条件下,麦角固醇含量可达2．2％,100ml发酵液中麦角固醇产量达25．30mg。     

谷氨酰胺转胺酶发酵条件的优化研究

通过优化种子培养条件和发酵培养基组分使谷氨酰胺转胺酵产酶水平有了很大的提高,确定种龄为20－24h,接种量8％左右。发酵培养基含淀粉15g/L、葡萄糖15g/L、蛋白胨25g/L、酵母膏3g/L、无水硫酸镁2g/L、磷酸氢二2g/L,无水磷酸二氢钾2g/L,24－28h添加质量浓度为0．5％的硫酸铵,在10L发酵罐实验中,验证了溶解氧对MTG合成至关重要,确定较适宜通气量1：1．25vvm,搅拌转速300mr/min,最高产酶单位最终稳定在3．2u/mL,放罐时间在44－46h左右较适宜。     

嗜酸乳杆菌P302菌株产类细菌素最佳条件的研究

目的对产类细菌素嗜酸乳杆菌P302的发酵条件进行研究。方法采用琼脂扩散法测定发酵上清液对大肠埃希菌O139的抑菌活性。结果通过正交试验确定P302产类细菌素的最佳培养基组分为牛肉膏4％、胰蛋白胨0．2％、酵母粉0．8％、碳酸钙0．4％和蔗糖1％,0．4％复合维生素,0．3％Tween-80有利于类细菌素的产生。发酵工艺条件为最适初始pH7．0,最适温度37℃,最佳接种量0．3％,种龄14h,厌氧培养22h。结论通过优化发酵条件和发酵工艺,类细菌素的产量提高了35％。     

苯甲酸1，2-双加氧酶高活力菌株的筛选和发酵条件的研究

从176株细菌中,筛选出苯甲酸1,2-双加氧酶的高活力菌株假单胞菌(Pseudomonas)137。进行了该菌产酶的发酵条件试验。产酶的最适温度为32℃,最适起始pH为6．5—7．0。葡萄糖、麦芽糖和甘油对产酶有明显的抑制作用,苯甲酸钠对产酶有促进作用。氨态氮对菌体生长和产酶是必需的。琥珀酸钠是酶形成的有效诱导物,采用0．1％苯甲酸钠和0．2％琥珀酸钠培养基(pH6．5—7．0),于32℃振荡培养72小时,可获得高活力的苯甲酸1,2-双加氧酶,每克菌体酶活力可达5-8单位。     

嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)液体发酵产生纤维素酶及酶学性质的研究

探讨了嗜热真菌Chaetomium thermophile产生纤维素酶的液体发酵条件及滤纸酶(FPA)的特性。采用液体发酵培养法,通过对碳源、氮源、培养时间、培养基的起始pH值及产酶过程中pH值和蛋白质含量变化的研究发现：在2％纤维素、1％可溶性淀粉为碳源;2．0％KNO3 0．2％酵母粉为氮源;起始pH值为6．5,50℃下培养9d后,各种酶活最高。发酵过程中,pH值和蛋白质的含量均在前3d下降,后升高。FPA的反应最适温度和pH值分别为60℃和5．5～6．0;且具有较高的热稳定性和DH稳定性。