表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

人类端粒酶催化亚基表达转录活性调控

端粒酶在肿瘤的发展和发展中起重要的作用。端粒酶催化亚基单位已称为人端粒酶逆转录酶,是端粒酶激活的限速因素。对端粒酶催化亚基单位的调节主要在转录水平,通过对其启动子的调控,一些转录因子如c-myc蛋白、Mad1、SP1、wtP53、人类乳头状瘤病毒16型E6癌蛋白、WT1及E2F等对HTERT的表达起着调节作用。     

表达不同致病型S基因重组鸡传染性支气管炎病毒的细胞嗜性研究

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在体外进行细胞培养比较困难,并且不同来源毒株在易感性上也存在差异。为揭示IBV适应CK细胞培养的分子基础,优化其细胞培养技术,本研究首先对H120疫苗株和IBYZ分离株的分子克隆株rH120和rIBYZ,在鸡胚、鸡气管环以及原代鸡肾细胞(CK)上培养时组织细胞的嗜性差异进行了比较,结果发现rIBYZ与rH120在CK上的亲嗜性存在显著差异。在此基础之上,课题组借助前期建立的IBV反向遗传操作系统,将H120疫苗株和IBYZ株的S基因进行交叉替换,成功拯救获得2株重组病毒rH120-S/YZ和rIBYZ-S/H120。通过比较不同毒株感染CK细胞后的病变、特异性免疫荧光的强度以及病毒的增殖曲线,表明刺突蛋白(S)在IBV适应CK细胞过程中发挥决定性作用。本文揭示了S蛋白对细胞嗜性的影响,为进一步探索IBV适应细胞的分子机制奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌SarA、IcaA及其融合基因的DNA疫苗构建及在小鼠免疫应答中的初步研究

目的:探究SarA-AG、IcaA-AG及IcaA-SarA-AG(Azami Green用AG表示)融合基因的DNA疫苗及对小鼠免疫应答的影响。方法:以金黄色葡萄球菌基因组为模板,通过PCR等反应进行SarA-AG、Ica A-AG及IcaA-SarA-AG融合基因DNA疫苗的构建,将DNA疫苗转染至HeLa细胞,荧光显微镜下观察DNA疫苗的瞬时表达情况,将转染成功2周后的细胞进行基因组提取,PCR检测质粒在染色体上的整合情况。使用AG、SarA-AG(A组)、Ica A-AG(B组)及Ica A-SarA-AG(C组) 4组免疫BALB/c小鼠,应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG抗体、IL-2、IL-4、IL-13、IFN-γ及TNF-α的分泌情况。结果:成功构建SarA-AG、IcaA-AG及Ica A-SarA-AG融合基因DNA疫苗,荧光显微镜下观察DNA疫苗转染情况,结果显示有绿色荧光。提取细胞基因组PCR检测结果显示未出现目的基因条带。免疫小鼠后,A、B、C组均能够诱导小鼠产生较高水平的IgG抗体。与空白组及空载体AG组相比,A、B组均能分泌较高水平的IL-2(P 0.001)、IFN-γ(P 0.001)、TNF-α(P 0.001)、IL-4(P 0.01)及IL-13(P 0.01),而C组TNF-α(P 0.05)、IL-4(P 0.05)及IL-13(P 0.05)分泌较少,但差异有统计学意义,细胞因子的分泌随着免疫次数的增加,差异显著增加。空白组及空载体AG组细胞因子无显著差异。结论:成功构建SarA-AG、IcaA-AG及IcaASarA-AG融合基因的DNA疫苗,且成功在真核细胞中表达。PCR验证结果证实了DNA疫苗的安全性。DNA疫苗免疫小鼠后可诱导体液免疫应答和以Th1细胞为主的细胞免疫应答,具有较好的应用前景。