IBV S1基因和IL-2基因双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究

为了研制更加有效的IBV DNA疫苗,将IBV的S1基因和禽白介素2(IL-2)基因插入双顺反子表达载体pIRES-EGFP/DsRed中,构建能分别或同时表达S1基因和IL-2基因的pIRES-S1、pIRES-IL2、pIRES-S1/IL-2质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,二免后两周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果表明,pIRES-S1/IL-2在体外能够诱导Vero细胞表达S1蛋白和IL-2;pIRES-S1/IL-2和pIRES-S1 pIRES-IL2免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强IBV DNA疫苗对同型强毒的攻击保护,但pIRES-S1/IL-2免疫组要优于pIRES-S1 pIRES-IL2混合免疫组及其它对照组,差异显著或极显著。以上结果表明禽IL-2能同时加强DNA疫苗的细胞免疫和体液免疫应答;但抗原基因和IL-2共表达DNA疫苗的免疫效果明显要优于混合注射的DNA疫苗。     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

人肿瘤浸润淋巴细胞的克隆化

肿瘤组织经机械剪切和酶消化分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL在含1000U/ml重组人白细胞介素-2(rhIL-2)的培养液中培养6d后,植入含1000U/ml rhIL-2的软琼脂半固体培养基中培养,7d后将形成的克隆转移到含rhIL-2的培养液中培养。~(51)Cr释放法测定结果表明,约30％的克隆对NK敏感的K562细胞和对NK不敏感的H7402肝癌细胞有细胞毒性,为具有杀瘤活性的TIL杀伤克隆(TIL-K)。60％以上TIL-K克隆在含IL-2的培养液中可持续地增殖2～3个月,其细胞数可扩增至10~8～10~9,并始终保持对肿瘤细胞的细胞毒性。TIL-K克隆的表型为CD3~ 、CD4~-、CD8~ 、CD16~-,有T细胞抗原受体β链基因的表达,说明其属T细胞系统。采用半固体-液体两步培养法可获取大量高纯度具有广谱杀瘤活性的TIL,本研究有助于TIL的深入研究和临床应用。     

应用绿色荧光蛋白研究外源基因在造血细胞的表达调控

以增强型绿色荧光蛋白为报道分子,研究双基因逆转录病毒载体介导小鼠骨髓细胞的基因转移中,SV(simianvirus)40启动子和内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)对双基因共表达的影响。构建双基因中间序列分别为SV40启动子和IRES的载体pLESN和pLEIN。经包装获得较高滴度的病毒上清,以共培养的方式感染5-氟尿嘧啶预刺激的小鼠骨髓细胞。流式细胞仪检测表明转染效率约25%,PCR证明EGFP基因整合至骨髓细胞基因组。半固体培养转基因细胞7d,LEIN组获得具有G418抗性的集落中98%表达绿色荧光,而LESN组54%。结果表明:在双基因逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓细胞的基因转导中,IRES与内部SV40启动子相比,更能保证双基因的共同表达。     

表达不同致病型S基因重组鸡传染性支气管炎病毒的细胞嗜性研究

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在体外进行细胞培养比较困难,并且不同来源毒株在易感性上也存在差异。为揭示IBV适应CK细胞培养的分子基础,优化其细胞培养技术,本研究首先对H120疫苗株和IBYZ分离株的分子克隆株rH120和rIBYZ,在鸡胚、鸡气管环以及原代鸡肾细胞(CK)上培养时组织细胞的嗜性差异进行了比较,结果发现rIBYZ与rH120在CK上的亲嗜性存在显著差异。在此基础之上,课题组借助前期建立的IBV反向遗传操作系统,将H120疫苗株和IBYZ株的S基因进行交叉替换,成功拯救获得2株重组病毒rH120-S/YZ和rIBYZ-S/H120。通过比较不同毒株感染CK细胞后的病变、特异性免疫荧光的强度以及病毒的增殖曲线,表明刺突蛋白(S)在IBV适应CK细胞过程中发挥决定性作用。本文揭示了S蛋白对细胞嗜性的影响,为进一步探索IBV适应细胞的分子机制奠定了基础。