IBV S1基因和IL-2基因双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究

为了研制更加有效的IBV DNA疫苗,将IBV的S1基因和禽白介素2(IL-2)基因插入双顺反子表达载体pIRES-EGFP/DsRed中,构建能分别或同时表达S1基因和IL-2基因的pIRES-S1、pIRES-IL2、pIRES-S1/IL-2质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,二免后两周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果表明,pIRES-S1/IL-2在体外能够诱导Vero细胞表达S1蛋白和IL-2;pIRES-S1/IL-2和pIRES-S1 pIRES-IL2免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强IBV DNA疫苗对同型强毒的攻击保护,但pIRES-S1/IL-2免疫组要优于pIRES-S1 pIRES-IL2混合免疫组及其它对照组,差异显著或极显著。以上结果表明禽IL-2能同时加强DNA疫苗的细胞免疫和体液免疫应答;但抗原基因和IL-2共表达DNA疫苗的免疫效果明显要优于混合注射的DNA疫苗。     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

江苏部分地区猪源结肠弯曲菌耐药性分析及多位点序列分型

【背景】弯曲菌(Campylobacter)是重要的人畜共患肠道病原菌,可通过食物链传播,引起人类腹泻性肠炎。【目的】了解猪源弯曲菌耐药特征和分子遗传特征,对江苏省10个规模化猪场进行弯曲菌分离和耐药性检测,并研究分离株的分子分型。【方法】采用琼脂平板稀释法进行最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)测定,PCR方法扩增耐药基因,以弯曲菌7个管家基因(aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA)为目的基因进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)研究。【结果】100份样品共分离出结肠弯曲菌22株,分离率为22%,弯曲菌检出情况与养殖规模和日龄无关(P>0.05)。耐药性试验结果显示,20株分离株为多重耐药菌株(81.82%,20/22),猪源结肠弯曲菌分离株对10种抗生素耐药程度不一,分别为：庆大霉素36.36%,链霉素50%,克林霉素27.27%,氯霉素13.64%,四环素40.91%,环丙沙星18.18%,萘啶酸63.63%,泰利霉素59.09%,红霉素100%,阿奇霉素81.82%;共检出了4种耐药基因[cfr、adE-Sat4-aphA、ermB和Tet(O)],检出率分别为4.5%、59.1%、9.1%和100%;多位点序列分型结果显示共获得11个ST型,主要流行CC-828克隆系(100%);进化树结果显示,所有分离株聚集归为2个大群,分别为2个分支和9个分支。χ2检验和Logistic回归模型表明共有3个序列型(sequence type,ST)与其相对应的抗菌药物有相关性。【结论】猪源结肠弯曲菌对大环内酯类抗生素具有较高的耐药性,Tet(O)基因检出率最高,分离株的序列型呈多样性。     

一株同时携带optrA和cfrC基因的猪源多重耐药结肠弯曲菌的全基因组测序

【背景】弯曲菌(Campylobacter)是一种世界范围内能引起胃肠炎的最常见食源性病原菌,对临床上重要的抗菌药物耐药越来越严重,对食品安全和公共健康造成重大威胁。【目的】研究一株同时携带optr A和cfr C基因的猪源结肠弯曲菌(Campylobactercoli)耐药表型和耐药基因,同时对该菌全基因组特征、毒力基因分布情况以及optr A和cfr C基因环境进行分析。【方法】采用琼脂平板稀释法进行最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)测定,并且对该菌进行全基因组测序。【结果】该菌株对四环素、克林霉素、阿奇霉素、氟苯尼考和利奈唑胺呈现高度耐药,对环丙沙星和庆大霉素敏感。全基因组测序得到一条大小为1 436 486 bp的环状DNA (GC含量为31.63%),携带四大类抗生素中共计12种耐药基因,均定位于染色体上,其中氨基糖苷类耐药基因数量最多。此外,携带包含黏附、侵袭和移动等相关毒力基因83个,其中与移动相关的毒力基因数量最多。对4个基因岛分析发现,基因岛GIs002和GIs003中含有耐药基因序列,cfr C位于基因岛GIs...     

表达不同致病型S基因重组鸡传染性支气管炎病毒的细胞嗜性研究

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在体外进行细胞培养比较困难,并且不同来源毒株在易感性上也存在差异。为揭示IBV适应CK细胞培养的分子基础,优化其细胞培养技术,本研究首先对H120疫苗株和IBYZ分离株的分子克隆株rH120和rIBYZ,在鸡胚、鸡气管环以及原代鸡肾细胞(CK)上培养时组织细胞的嗜性差异进行了比较,结果发现rIBYZ与rH120在CK上的亲嗜性存在显著差异。在此基础之上,课题组借助前期建立的IBV反向遗传操作系统,将H120疫苗株和IBYZ株的S基因进行交叉替换,成功拯救获得2株重组病毒rH120-S/YZ和rIBYZ-S/H120。通过比较不同毒株感染CK细胞后的病变、特异性免疫荧光的强度以及病毒的增殖曲线,表明刺突蛋白(S)在IBV适应CK细胞过程中发挥决定性作用。本文揭示了S蛋白对细胞嗜性的影响,为进一步探索IBV适应细胞的分子机制奠定了基础。     

三种丛枝菌根真菌对茅苍术的生长、生理及主要挥发油成分的影响

在温室条件下研究了3种丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungus,AMF):Glomus etunicatum BGC AM0048(A1)、Glomus tortuosum BGC AM0001(A2)和Glomus mosseae BGC AM0045(A3)对茅苍术组培苗的成活率、生长、生理特性及挥发油积累的影响。结果表明:接种AMF均提高了茅苍术组培苗的移栽成活率;苍术苗移栽35 d后,3个接种组的菌根侵染率由高至低依次为A3(63.39%)、A2(47.81%)和A1(42.41%);菌株对苍术苗的生长促进作用与侵染率规律一致,以A3对苍术苗的生长促进作用最明显,苍术苗的单株株高、单株根长、单株叶片数较对照组分别增加了21.9%、65.%和38.7%,各项检测指标与对照组的差异均达到显著水平;AMF处理组叶片中抗病相关酶系(PAL、PPO和β-1,3-葡聚糖酶)、抗氧化酶系(SOD、CAT和POD)的活性和叶绿素含量均有不同程度的提高,且接种AM真菌均促进了苍术苗挥发油中3种主要成分苍术醇、β-桉叶油醇和苍术素的积累。不同的AMF与植物之间具有偏好性,在人工栽培中,G.mosseae BGC AM0045菌株可作为茅苍术苗菌根化处理的优良菌株。