关于我国药典重组DNA技术产品总论的思考

自1982年全球第一个生物技术药物“基因重组人胰岛素”、1989年中国批准第一个生物技术药物“重组人干扰素α1b”上市以来,生物技术药物已成为制药业中发展最快、活力最强和技术含量最高的领域。药品的规范生产与质量控制与其安全有效性密切相关,欧美药典中均设有对此类药品质量控制的总体要求。《中国药典》2010版三部已收录包括12类共计34个品种的重组DNA技术产品各论,在进一步保障药品安全、提高质量控制水平的编制指导思想下,《中国药典》2015版拟纳入对重组DNA技术产品的总体要求,本文就相关起草工作从产品涉及范畴、制造与产品检定等方面进行阐述。     

美国、欧盟和中国生物技术药物的比较

按照相同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为同种产品,而不同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为不同产品的原则,归纳总结了美国、欧盟和中国已批准上市的生物技术药物。美国FDA批准的以基因工程产品、抗体工程产品和细胞工程产品为主要代表的生物技术药物共79种(18种为大肠杆菌表达,8种为酵母表达,53种为哺乳动物细胞培养生产),其中基因重组蛋白质药物为64种。欧盟批准了49种基因重组酶、激素或细胞因子,11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。在欧美60％-70％的产品由哺乳动物细胞表达。中国批准了27种生物技术药物。比较了美国、欧盟和中国生物制药的特点。     

不同接头的白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究

毕赤酵母作为比较成熟的真核表达系统[1],它具有许多优点,表达产物直接分泌到胞外,这有利于产物的分离纯化.白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究也具有很重要的意义.研究白蛋白与干扰素之间的接头蛋白不同对表达量的影响.通过重叠PCR构建不同接头的白蛋白干扰素重组子,然后分别用salⅠ酶切线性化,通过电转仪转入毕赤酵母SMD1168,在MD板上进行培养,分别挑取10个克隆进行甲醇诱导表达,筛选出表达量最高的一个.最后在相同的条件下,分别将表达量高的进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,由于表达产物中有杂蛋白,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量,由已知浓度的白蛋白干扰素标准曲线,可以计算出不同接头的白蛋白干扰素的表达量,这对工业化生产具有指导意义.     

重组人干扰素α1b抗新型冠状病毒的基础和临床研究进展

干扰素是机体抗病毒的第一道天然防线,干扰素α1b是中国人干扰素家族中主要的抗病毒表达亚型。SARS-CoV-2通过多种途径抑制先天免疫关键分子干扰素的产生。已上市多年的重组人干扰素α1b显示出强大的体外抗SARS-CoV-2病毒活性。初步临床研究显示,包括重组人干扰素α1b在内的I型干扰素对COVID-19显示出积极的治疗和预防作用。全球多个国家正在开展干扰素治疗COVID-19的临床试验,我国自主知识产权的重组人干扰素α1b率先开展了验证性临床试验。     

玉米生物育种基础研究与关键技术

干扰素是机体抗病毒的第一道天然防线,干扰素α1b是中国人干扰素家族中主要的抗病毒表达亚型。SARS-CoV-2通过多种途径抑制先天免疫关键分子干扰素的产生。已上市多年的重组人干扰素α1b显示出强大的体外抗SARS-CoV-2病毒活性。初步临床研究显示,包括重组人干扰素α1b在内的I型干扰素对COVID-19显示出积极的治疗和预防作用。全球多个国家正在开展干扰素治疗COVID-19的临床试验,我国自主知识产权的重组人干扰素α1b率先开展了验证性临床试验。     

干扰素基因工程菌产物表达数学模型的研究

根据阻遏蛋白,辅阻遏因子与启动基因之间的相互作用,建立了采用色氨酸启动子的基因工程重组徽生物的产物表达数学模型。提出了mRNA最大转录速率常数和产物表达速率常数与比生长速率呈线性关系的假设,用干扰素基因工程菌培养过程中的实验数据估计了mR—NA转录速率常数,干扰素表达速率常数和干扰素降解速率常数。推导出了发酵过程中干扰素表达量和细胞内干扰素比活计算公式。运用这些公式可以通过检测色氨酸浓度和细胞比生长速率来计算预测干扰紊表达量。确定最佳的终止培养时间。     

Ⅲ型干扰素——新型抗病毒细胞因子

干扰素（IFN）是抗病毒感染的第一道防线,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素不仅可抑制病毒,而且还能参与天然免疫反应和获得性免疫反应。最近干扰素家族增添一位新成员：Ⅲ型干扰素,即IFN-λ,因其具有类似干扰素的抗病毒活性且能诱导干扰素相关基因的表达而命名。IFN-λ受体与Ⅰ型干扰素的受体不同,但具有与Ⅰ型干扰素类似的诱导表达方式和信号转导通路,并能激活一系列相似的干扰素刺激基因。就IFN-λ家族及其受体、基因表达和信号转导机制、抗病毒作用等进行综述。     

黄鳝IRF-4和IRF-10的表达研究

目的:干扰素调节因子是一类能够调控干扰素及其相关免疫基因表达的转录因子,研究黄鳝干扰素调节因子的结构及表达有助于阐明黄鳝抗病毒的机理。方法:利用PCR扩增技术获得了黄鳝干扰素调节因子10(IRF-10)和IRF-4的部分cDNA序列,再利用半定量PCR技术检测了黄鳝不同发育阶段、不同组织IRF-10和IRF-4的表达。结果:IRF-10和IRF-4在黄鳝三个不同的发育阶段表达量基本一致,但两者在黄鳝不同组织表达呈现明显的差异,IRF-10组成型表达于黄鳝各个组织中,而IRF-4仅在肠、中肾和脑中呈现很高的表达,其他组织表达很弱。结论:IRF-10组成型地表达于黄鳝各个组织,且表达量很高;而IRF-4中仅在主要免疫器官表达,且表达量较弱。     

慢性乙型肝炎抗病毒药物的选择

慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究有了明显的进展.1998年前,抗乙型肝炎病毒(HBV)注册药物只有标准α干扰素;1998年之后,核苷(酸)类似物拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定相继用于临床;2005年聚乙二醇化干扰素α-2a(PAGasys)批准上市用于慢性乙型肝炎治疗.这些研究的进展,一方面使临床医生在慢性乙型肝炎抗病毒治疗时有了更多的选择,另一方面也使临床医生在决定治疗方案时面临困难.     

人α1型干扰素克隆菌的表达研究——I.内外源基因表达特性

在E.coli表达系统中,克隆的外源基因的表达水平往往有较大的差别。例如,Goeddel等构建的α干扰素克隆菌的产量达2.5×10~8u/l,而在Gray等构建的γ干扰素表达系统中,干扰素产量只有2.5×10~4u/l。这种差别及实际应用的要求推动了人们对影响外源基因表达的各个因素进行研究。过去几十年中,由于生物化学及分子生物学家们的努力,对E.coli内源基因表达调控的规律有了许多认识。目前在研究E.coli中克隆的外源基因的表达调控时,往往也是借鉴这方面的成果。 克隆菌E.coli MEC101(pBV37)含有一选择性标记Ap~r目的基因IFN,它们来源不同,就宿主而言分别属于内源基因和外源基因。本文就这两个基因的表达特性进行了研究和比较。     

中美生态分区及其分级体系比较研究

生态分区及其分级体系越来越多地用于环境保护政策的制定和管理决策,尤其是在自然资源管理、保护和评价方面。目前世界上有许多生态分区及其分级体系,不同的生态分区与分级体系使用不同的生态分区方法和各种指标。如何正确评价和选择这些生态分区及其分级体系进行自然资源管理和环境决策,已经成为管理者和研究者的一个难题。概述了近20a来生态分区分级研究现状与国际进展,重点比较、分析了美国主要生态分区及其分级体系与中国生态功能分区之间的差异。结果表明,在生态分区的分区单元内涵、侧重点以及分区角度3个方面,中美之间有显著的不同。美国的生态分区及其分级体系多注重自然生态系统,尤其在其评价指标中,人类在生态系统中的地位与生态系统内其他生物相平等。而中国的生态功能分区,则更加突出人类在生态系统中的地位以及生态系统为人类社会提供的生态服务功能。这些体系各有优点和缺陷。通过这些体系的比较研究,可为中国后续水生态分区研究和改进中国生态功能分区提供参考和建议。     

基因创造神奇的生命

自从人类发现了基因,世界上的生命就变得神奇起来了。基因是一段有功能的脱氧核糖核酸序列。载有基因的脱氧核糖核酸分子在生命体内组合在一起叫染色体,这些染色体把亲代生物的遗传性状一代代传下去。这就是遗传。生命在几亿年前起源于一体,不同生物物种的基因可以通用。遗传工程就是在不同物种之间架起一道桥梁,实现基因交流。 1988年,中国科学院遗传研究所在世界上第一次将人的干扰素基因拼接到烟草上,并得到表达。这样,烟草作为人干扰素的“制品厂”,可以戴罪立功,为人造福。人     

人干扰素epsilon(IFN-ε)研究进展

人干扰素epsilon(IFN-ε)属于Ⅰ型干扰素,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学作用,目前国内外对其研究不多,是一种有待开发的新型干扰素。本文就IFN-ε的基因结构、表达方式、表达位置、受体、受体配体的作用途径、生物学作用以及临床应用的前景等方面,进行了比较系统的归纳和总结。     

重组蛋白质在酵母表达体系中的高效表达策略

酵母由于其本身的一些优良特性和容易操作性,可以高水平表达重组蛋白,近年来已经有多个酵母表达的蛋白质多肽类药物上市。作为宿主的酵母最常用的是毕赤氏酵母和酿酒酵母。本文对酵母的一般特性、酵母表达操作、密码子、载体和表达策略、两种不同酵母表达系统的特点等进行了论述,供研究者进行酵母高效表达体系的选择与操作参考。     

基因重组人干扰素的实验室研究

<正>人α-、-β和γ-干扰素的前临床和临床研究的结果证明了其抗病毒、抑制增生和免疫调节的作用,使人们对该制品产生了很大兴趣。直到不久前还用人白细胞干扰素作临床试验,因血源白细胞来源不足而受限。基因工程的成就使干扰素有可能投入工业生产。一些国家使三种干扰素基因在细菌和酵母菌上表达并获得了相应活性蛋白。对基因重组干扰素的研究证明在生物学特性和药理学作用方面与天然干扰素本无本质的区别,同时对人体无害,对于疱疹、肝炎、副流感     

甲型流感病毒感染过程中干扰素介导的天然免疫应答机制

甲型流感病毒作为引起人类和动物急性呼吸道传染病的一个主要病原体,在世界范围内广泛流行。研究表明,甲型流感病毒感染宿主后会诱导宿主的天然免疫应答。甲型流感病毒感染可引起Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)和RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ like receptors,RLRs)等宿主模式识别受体介导的抗病毒信号通路的活化,并在多种机制调控下诱导干扰素和其他细胞因子的表达,如Ⅰ型干扰素、Ⅲ型干扰素等,从而启动干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs)的转录及其抗病毒蛋白的表达,进而实现抗病毒作用。本文就甲型流感病毒感染与干扰素介导的天然免疫应答相关的信号通路和调控机制进行综述。     

干扰素调控因子3：细胞抗病毒反应的核心转录因子

固有免疫系统是宿主抵御病毒入侵的第一道防线．Ⅰ型干扰素是关键的抗病毒细胞因子,它在细胞建立抗病毒状态的过程中发挥了核心的作用．Ⅰ型干扰素的诱导表达是固有免疫的重要调节与效应机制．已有的研究表明：多种转录因子(NF-kappa B、ATF-2/c-Jun、IRF3、IRF7)通过在Ⅰ型干扰素的转录调控区形成稳定的转录增强复合物(enhanceosome),迅速并大量地诱导Ⅰ型干扰素表达．体内与体外的生物学分析已确立,干扰素调控因子3 (IRF3)是介导细胞表达Ⅰ型干扰素最关键的转录因子,其转录活力与生物学功能直接影响细胞的抗病毒的能力．近年来,IRF3相关的细胞信号转导与调控机制等研究取得重大进展．围绕IRF3的结构、功能以及分子调控机制等方面,概述相关的研究进展,并做前沿展望．     

人肿瘤坏死因子与人γ干扰素重组双功能融合蛋白的研制

肿瘤坏死因子与γ干扰素具有非常相似的生物学活性,并在一些主要的生物活性方面表现有较强的协同作用。本文采用寡核苷酸指导下的定位缺失-插入体外基因突变技术,删除了干扰素与肿瘤坏死因子串联基因之间的非编码区,去徐了γ干扰素的翻译终止信号,插入了一个人工设计的连接肽,使γ干扰素与肿瘤坏死因子基因在不改变读码框架的条件下融合起来,并在大肠杆菌表达系统中表述了兼有γ干扰素和肿瘤坏死因子功能的融合蛋白。     

干扰素系统与病毒的相互作用

干扰素是最早发现的细胞因子之一,不同类型的IFN生物活性基本相同,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。病毒侵染细胞,诱导细胞产生IFN,IFN通过不同的作用机制启动宿主防御系统,激活酶和作用因子来拮抗病毒的侵染、复制和转录过程。正因为干扰素在抗病毒防御过程中的关键作用,因此病毒已经衍生出了有效的方式能够成功的侵染宿主。病毒通过表达一些拮抗蛋白来干扰IFN的诱导产生、IFN的信号转导或效应蛋白的作用,从而终止干扰素的产生并破坏干扰素诱导的其它因子的作用来逃避干扰素的作用。     

mRNA翻译起始区二级结构改变对干扰素基因在大肠杆菌中翻译的影响

为研究mRNA翻译起始区结构与基因表达的关系,利用密码子的简并性,在不改变表达产物氨基酸序列的前提下定点突变α8干扰素及αA干扰素衍生物基因的5′端若干位点,使其与表达载体重组后转录形成的mRNA翻译起始区结构发生改变。SDS-PAGE及活性测定证实这些改变提高了外源基因的表达水平。RNA斑点印迹表明突变前后基因转录水平差别不大,表达水平的提高主要由于翻译效率的提高。mRNA翻译起始区二级结构预测提示其生成自由能(ΔG)的变化可能与表达水平的提高有关。