蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析

利用RT-PCR及RACE技术,克隆到蝴蝶兰1个几丁质酶基因PhCHT(GenBank登录号为KT992851),该基因cDNA全长1 210bp,包含37bp的5′-UTR、933bp开放阅读框和240bp 3′-UTR,编码310个氨基酸;该蛋白为糖苷水解酶第19家族成员,兼具有溶菌酶活性;生物信息学分析显示,该蛋白具N-端信号肽和跨膜结构,为胞外分泌蛋白;该蛋白与海枣、谷子、油棕和拟南芥的几丁质酶类似蛋白相近,并且在系统进化树上与甘蔗和陆地棉的Ⅶ类几丁质酶同属一个分支。PhCHT基因的表达分析表明,PhCHT在蝴蝶兰营养器官和生殖器官中均有表达,根中表达量最高;13℃/8℃低温处理3、6、9和15d时该基因的表达被抑制,4℃低温处理1、2和4h表达量升高。研究表明,PhCHT基因能够响应短期的冷胁迫。研究结果为进一步研究蝴蝶兰几丁质酶的系统进化及抗性育种奠定了基础。     

荒漠昆虫小胸鳖甲水通道蛋白基因MpAQP1克隆及低温对其表达的影响

水通道蛋白(aquaporin,AQP)参与细胞的水分平衡与运输,与生物的抗逆性相关,但AQP在昆虫耐寒性中的作用仅有少量报道。为了检测昆虫AQP基因的序列特征及其表达是否与低温相关,本研究从荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis中克隆获得AQP的开放阅读框(ORF)序列,命名为MpAQP1(Gen Bank登录号:KX129951)。生物信息学分析表明,MpAQP1的ORF长度为813 bp,编码270个氨基酸,分子量为28.59 kDa,理论等电点为7.73。MpAQP1属于萤火虫内嵌蛋白(PRIP)家族,具有6个跨膜结构域和5个螺旋环,含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸基序(NPA基序)。实时荧光定量PCR检测MpAQP1在低温下的表达谱发现,4℃低温处理1 h,MpAQP1开始上调表达,5 h达到最高峰,为对照组的34.39倍。研究表明MpAQP1为冷响应基因,水通道蛋白可能参与小胸鳖甲低温下的渗透调节而发挥耐寒性功能。     

荒漠甲虫小胸鳖甲低温响应几丁质酶基因Mpcht19的克隆及表达模式分析

【目的】探索荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis低温响应的分子机理并挖掘其耐寒基因。【方法】根据低温转录组数据筛选并克隆小胸鳖甲几丁质酶基因,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分析该基因在成虫不同组织中和4℃低温胁迫下的表达模式分析。【结果】从小胸鳖甲成虫克隆获得一个几丁质酶基因Mpcht19(Gen Bank登录号:KY126382)。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白Mp CHT19属于Ⅳ型昆虫几丁质酶,理论分子量约为27.18 k D,无信号肽,具亲水性。系统进化分析表明,Mp CHT19与赤拟谷盗Tribolium castaneumⅣ型几丁质酶Tc CHT19同源性最高,氨基酸序列一致性为34.05%。实时荧光定量PCR结果显示,Mpcht19在成虫脂肪体和后肠中高表达,具有组织特异性;该基因的表达还受4℃低温诱导。免疫组织化学分析结果显示,在4℃低温下Mp CHT19蛋白在脂肪体和后肠中表达。【结论】Mpcht19基因的表达具有组织特异性,并受低温诱导。研究结果有助于深入研究几丁质酶与小胸鳖甲耐寒性的关系。     

准噶尔小胸鳖甲短时低温胁迫响应的转录组分析

【目的】拟步甲科昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis是分布于中国新疆古尔班通古特沙漠的特有物种,具有很强的耐寒性,但其低温响应的分子机制尚不明确。本研究旨在利用转录组测序技术丰富小胸鳖甲的已知基因信息,分析在短时低温胁迫下,上调表达基因的主要类群及参与的主要代谢通路。【方法】利用Trinity软件对分别在4℃低温和25℃(对照)下处理3 h的小胸鳖甲成虫RNA-Seq数据进行从头组装,利用Blast2go软件进行基因注释。通过DESeq和GFOLD软件分析差异表达基因,并对上调表达基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径富集分析。【结果】测序过滤后得到68 165 001个有效读序,51 712个平均长度为984 bp的非冗余基因,其中29 925个基因(约57.87%)有同源序列(E-value10-5),与拟步甲科的赤拟谷盗Tribolium castaneum相应基因相似性最高(核苷酸序列一致性为72.75%)。低温响应上调表达基因有514个,富集到35个GO类群,18个KEGG途径。其中胁迫响应类群、生物调节类群和免疫系统过程类群都占有重要比例,嘌呤代谢、硫胺素代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路显著富集。在胁迫响应类群中,热激蛋白Hsp90基因、超氧化物歧化酶(SOD)基因和钙联接蛋白Calnexin基因等8个非生物胁迫相关基因显著上调表达。【结论】荒漠昆虫小胸鳖甲低温转录组揭示,在4℃冷驯化过程中,代谢过程、胁迫响应、生物调节和免疫系统等生物学过程相关基因表达显著上调,其中几个非生物胁迫响应基因提示小胸鳖甲可能从分子伴侣、细胞周期阻滞、线粒体稳定性、抗氧化胁迫等多方面应对低温胁迫。KEGG富集分析所揭示的小胸鳖甲在低温下的转录组代谢通路与其他物种有较大差异。研究结果为后续生物信息学分析及小胸鳖甲耐寒关键基因的发掘及耐寒机制的揭示提供了基础数据。     

莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】为揭示昆虫病原真菌分泌的几丁质酶对宿主感染致病时的作用,对莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因进行了克隆与表达,并检测了表达产物的活性。【方法】采用CTAB法提取菌体DNA,设计特异性引物,多次PCR扩增克隆莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全序列,并克隆基因的ORF片段chit1,与载体pPIC9K相连接,构建表达载体pPIC9K-Chit1,转入毕赤酵母感受态细胞中,然后通过1.5mg/L浓度的G418筛选及PCR验证,将阳性转化子进行诱导培养,对发酵液分别进行酶活性测定试验、几丁质酶透明圈验证试验和SDS-PAGE电泳检测。【结果】莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全长序列为2756bp(NCBI登录号:EU795711),PCR扩增得到开放阅读框ORF片段chit1为1827bp,其中包含3个内含子,5′端非编码区长76bp,3′端非编码区240bp,编码424个氨基酸的几丁质酶前体,理论信号肽剪切位点在Gly(20)与Leu(21)之间;毕赤酵母重组细胞发酵液中几丁质酶活性随着发酵时间的延长而增加,72h达到最大值482.5U/100μL,透明圈活性验证试验显示,在含1%的几丁质平板上可出现明显的透明圈,表达产物SDS-PAGE电泳检测其分子量为41.0kDa。【结论】本研究克隆到莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因,其ORF成功重组到毕赤酵母中并表达出有活性的几丁质酶。基因表达产物的利用对进一步研究病原真菌染病昆虫的机制等具有重要意义。     

朝鲜淫羊藿EkCDPK基因的克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase, CDPK)是在植物抗逆胁迫信号转导途径中起关键作用的酶。该研究采用RT-PCR结合RACE技术,从朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)中克隆获得一个全长2 036 bp的钙依赖蛋白激酶基因(EkCDPK)。结果显示:(1)EkCDPK基因cDNA为1 410 bp,5′-UTR长387 bp, 3′-UTR长239 bp,编码469个氨基酸。EkCDPK蛋白保守结构域N端为S_TKc domain,C端为EF-hand domain,该蛋白具有1个CDPKs典型结构Ser/Thr蛋白激酶活性位点、1个ATP位点、4个Ca~(2+)结合位点、1个跨膜结构域、无信号肽的稳定亲水性蛋白质,二级结构主要由α-螺旋(43.71%)和无规则卷曲(37.10%)构成。(2)系统进化分析表明,EkCDPK与菘蓝CDPK蛋白表现出较高相似性(95%)。(3)实时荧光定量PCR分析表明,EkCDPK基因在根、茎、叶与花组织中均有表达,根中表达量最高,茎次之;干旱胁迫后15 h内表达量显著高于对照组,之后表达量开始下降;盐胁迫5、15和25 h后EkCDPK基因表达量均明显高于对照组。(4)成功构建了pET-28a-EkCDPK原核表达载体,诱导出约50 kD蛋白质,与预测大小一致,表明重组蛋白EkCDPK表达成功,为采用基因工程手段提高朝鲜淫羊藿抗逆性能研究奠定了基础。     

荒漠昆虫小胸鳖甲Ras GTP酶激活蛋白基因 MpRasGAP 的克隆及低温表达分析

【目的】丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK)级联是细胞的重要信息传递系统之一,Ras GTP酶激活蛋白（Ras GTPase-activating protein, RasGAP）基因 RasGAP 和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）基因 JNK 分别是MAPK信号转导途径的上、下游基因。本研究旨在确定荒漠昆虫小胸鳖甲 Microdera punctipennis RasGAP 及 JNK 基因对低温的响应情况。【方法】从荒漠甲虫小胸鳖甲中克隆获得 RasGAP 基因的cDNA序列,利用生物信息学分析软件分析其氨基酸序列并构建进化树,利用实时荧光定量PCR检测低温胁迫条件下 RasGAP 和 JNK 基因的表达情况。【结果】小胸鳖甲RasGAP cDNA的开放阅读框2 523 bp,命名为 MpRasGAP （GenBank登录号：KM677930）,编码840个氨基酸,分子量96.594 kDa,编码蛋白MpRasGAP属于RasGAP超家族。MpRasGAP与赤拟谷盗 Tribolium castaneum RasGAP的氨基酸序列一致性达89%。小胸鳖甲在4℃和-4℃低温胁迫1 h后,MpRasGAP 的mRNA水平都显著高于室温对照（25℃）。小胸鳖甲在4℃处理3 h或-4℃处理1 h后, MpJNK 的mRNA水平也显著升高。【结论】本研究结果表明小胸鳖甲MpRasGAP 和 MpJNK 的mRNA水平受低温诱导。研究结果有助于深入研究荒漠昆虫在低温下MAPK信号转导途径的作用机制。     

新疆盐穗木GRAS转录因子基因克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科盐穗木属盐生植物盐穗木中分离得到了一个盐胁迫响应的表达序列标签(EST)片段,结合SMARTTMRACE技术获得了盐穗木GRAS转录因子基因的cDNA。序列分析表明,该基因全长2 090bp,含有1 635bp的阅读框,294bp的5′-UTR和161bp的3′-UTR,编码544个氨基酸,分子质量为61.503kD,理论等电点为6.1。系统进化树和Blast同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GRAS家族特有的C端保守结构域,并与葡萄GRAS家族蛋白VvSCL13聚集在一起,故将该基因命名为HcSCL13(GenBank登录号KC68640)。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,HcSCL13基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测Hc-SCL13基因可能与盐穗木的耐盐性相关。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(Gen Bank登录号为MG604929),该基因长1 431 bp,包含开放阅读框长1 134 bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156 k D。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。     

小胸鳖甲热激蛋白基因(Mphsp70)的克隆、序列分析及温度对其表达的影响

采用RACE-PCR技术,从荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab克隆hsp70基因全长cDNA序列,命名为Mphsp70。测序结果表明,序列全长2207bp,该序列覆盖了完整编码区,编码647个氨基酸,分子量大小为70.69ku,理论等电点为5.57(GenBank登录号JF421286.1)。此序列包含142bp的5'端非翻译区和124bp的含有多聚腺苷酸信号序列AATAAA和poly A尾的3'端非翻译区以及1941bp的开放阅读框。该基因无内含子,符合诱导型Hsp70的特征。经BLAST检索分析,由Mphsp70的核苷酸序列推定的氨基酸序列与已知的光滑鳖甲Hsp70高度同源,同源性高达97.22%。通过荧光定量RT-PCR技术研究昆虫受到高温胁迫时该基因的表达,结果表明:经37℃和42℃处理昆虫1h后诱导昆虫体内hsp70的表达,其表达量分别为对照组(25℃)的21.57倍和389.3倍,随着处理时间的延长,表达量降低。该研究结果为深入研究小胸鳖甲的抗逆机理提供了新的思路。     

荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测

目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8 h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8 h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上。结论利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。     

金钱鱼Sox9 cDNA克隆及其表达分析

为了解Sox9基因在金钱鱼(Scatophagus argus)性腺分化中的作用,本研究利用c DNA末端快速扩增法(RACE)克隆了金钱鱼Sox9基因c DNA全长序列,同时研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)(50 mg/kg)后该基因的表达及其性腺的组织学变化。金钱鱼Sox9 c DNA全长2 759 bp,包括5′非翻译区(5′-UTR)31 bp、3′非翻译区(3′-UTR)1 288 bp和开放阅读框(ORF)1 440 bp,编码479个氨基酸。该氨基酸序列104~172位为HMG保守盒,在该盒内存在一个特征性基序,两个核定位信号NLS及一个富含亮氨酸的核输出信号NES。该序列与赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的相似性最高,为96.0%,与非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、原鸡(Gallus gallus)、小家鼠(Mus musculus)等物种的相似性为61.5%~76.1%。Real-time PCR显示,金钱鱼Sox9基因在脑、鳍、精巢中表达量较高。组织学研究表明,芳香化酶抑制剂来曲唑能有效诱导金钱鱼发生不同程度的性逆转,性腺中卵母细胞退化,精原细胞增殖。Real-time PCR结果显示,金钱鱼Sox9基因在来曲唑处理20 d后开始不断上升,于处理后第40天时达到最高值,在第60天时表达量迅速下降。上述结果表明,金钱鱼Sox9基因高度保守,可能在金钱鱼性腺雄性化过程中起重要作用。     

东亚飞蝗中肠几丁质酶基因的克隆、序列分析及组织定位

通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)几丁质酶基因 (LmChi)cDNA全序列 (GenBank 登录号：EF092841)。获得的cDNA全长1 604 bp,其中可读框1 452 bp, 编码483个氨基酸。推测其氨基酸序列与18家族昆虫几丁质酶有较高的相似性。与其他几丁质酶一样,东亚飞蝗几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个碳端丝氨酸富集区和一个几丁质结合域。半定量RT-PCR研究表明,LmChi基因只在东亚飞蝗不同发育阶段的中肠组织中表达,而在东亚飞蝗体壁、前肠和后肠均没有发现LmChi基因的转录。     

苏云金芽孢杆菌chiA,chiB全基因的克隆、表达及其序列分析

以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。     

舞毒蛾几丁质酶基因的真核表达与重组病毒的获得

几丁质是昆虫外骨骼和围食膜的重要组成部分,鉴于几丁质酶在昆虫生长发育过程中发挥着举足轻重的作用,应用昆虫几丁质酶为探索新的生物防治害虫的方法提供了途径。本文分别根据苜蓿银纹夜蛾Autographa californica核型多角体病毒多角体蛋白基因序列和编码舞毒蛾Lymantria disparⅠ型几丁质酶基因的开放阅读框设计引物,使用聚合酶链反应扩增出以上两个基因,全长分别为783 bp和1 737 bp。构建重组质粒pFastBac-LdCht和pFastBac-AcPH-LdCht,转化大肠杆菌DH10Bac后获得重组穿梭载体,通过脂质体介导转染Sf9细胞产生重组杆状病毒AcMNPV-AcPH--LdCht和AcMNPV-LdCht,分别用于表达蛋白和获得重组病毒。细胞成功表达出有活性的舞毒蛾几丁质酶,并在棉铃虫体内扩增得到重组病毒。研究为深入了解昆虫几丁质酶性质提供依据,并为应用重组病毒奠定基础。     

杆状病毒几丁质酶基因结构与功能的研究进展*

杆状病毒几丁质酶基因是杆状病毒的非必需基因 ,是高度保守的基因。该基因在杆状病毒复制晚期表达产生几丁质酶 ,该酶N端具信号肽 ,中部是酶的活性区 ,C端是酶的内质网结合区。杆状病毒几丁质酶同时具有内切和外切几丁质酶活性 ,主要功能是水解昆虫体内的组成型几丁质。杆状病毒几丁质酶对于虫体液化是必需的 ,同时它还是原组织蛋白酶 (pro V Cath)的分子伴侣 ,并与病毒侵染机制相关联。杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因可能源于共同的祖先。     

荒漠昆虫小胸鳖甲抗菌肽Attacin基因的克隆及低温表达模式分析

昆虫在低温冷驯化过程中会发生很多基因表达的改变, 从转录组层面上开展广泛的研究有助于全面认识昆虫对冷响应的分子机制。为了对荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的 4℃低温转录组数据中一个上调表达的Attacin基因（MpAttacin1）进行深入了解并分析其对低温诱导的响应情况, 本研究通过生物信息学分析对该基因进行了鉴定, 并利用实时荧光定量PCR对其在低温下的mRNA水平进行了检测。结果表明： 获得的MpAttacin1 cDNA长度为523 bp, 包含一个456 bp的开放阅读框和67 bp的5′端非翻译区。MpAttacin1编码含有151个氨基酸残基的多肽, N端含有17个氨基酸的信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与其他鳞翅目、 双翅目和鞘翅目昆虫的抗菌肽Attacin具有30%~40%的一致性。以邻接法（neighbor-joining, NJ）构建的系统进化树表明, 小胸鳖甲Attacin1与其他鞘翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attacin_C超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示, 在4℃与-4℃低温胁迫时, MpAttacin1基因的转录都呈现先升高后降低的应激反应趋势, 但在对低温的响应时间和强度上有所不同。在4℃处理5 h和9 h后, MpAttacin1的表达量分别为对照组的2.3和3.8倍, 而在-4℃处理7 h和9 h后, 分别为对照组的2.4和1.5倍。这些研究表明, 除已知的抗菌功能外, Attacin在昆虫的低温适应过程中可能也发挥着重要的作用。     

杆状病毒几丁质酶基因结构与功能的研究进展

杆状病毒几丁质酶基因是杆状病毒的非必需基因,是高度保守的基因。该基因在杆状病毒复制晚期表达产生几丁质酶,该酶N端具信号肽,中部是酶的活性区,C端是酶的内质网结合区。杆状病毒几丁质酶同时具有内切和外切几丁质酶活性,主要功能是水解昆虫体内的组成型几丁质。杆状病毒几丁质酶对于虫体液化是必需的,同时它还是原组织蛋白酶(pro-V-Cath)的分子伴侣,并与病毒侵染机制相关联。杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因可能源于共同的祖先。     

粉棒束孢几丁质酶基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

通过设计基因保守区的特异性简并引物,运用SMARTRACERT-PCR技术,首次从粉棒束孢中克隆出完整的几丁质酶基因。该基因cDNA全长1549bp,5'端非翻译区89bp,3'端非翻译区有188bp,开放阅读框(ORF)1272bp,编码423个氨基酸。信号肽长度为22个氨基酸。信号肽很可能需要两次剪切。成熟的蛋白理论分子量为43.9kDa,理论等电点为5.67。氨基酸序列具有几丁质酶18族的两个高度保守的活性区域,一个是酶作用活性位点,另一个是几丁质结合区域。该蛋白可归于几丁质酶18族V类。成熟蛋白的氨基酸序列与裂虫壳AAV98691、白色扁丝霉CAA45468、菌生轮枝孢AAP45631、莱氏野村菌AAP04616和球孢白僵菌AAN41261的同源性分别为91%,89%,80%,76%和75%。     

无苞芥NAC转录因子基因OpNAC026的克隆与分析

在新疆耐逆植物无苞芥幼苗cDNA文库的随机克隆测序结果中,发现1条与拟南芥NAC转录因子基因AtNAC026高度相似的5′端EST序列(GenBank登录号为JZ151854),对该克隆进行3′端测序,拼接得到一条全长1 327bp的cDNA序列,该序列包含一个906bp的最大开放阅读框(ORF),推测编码301个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术对其进行克隆,将该基因命名为OpNAC026(GenBank登录号为KM457621)。理化性质分析表明,OpNAC026蛋白是一个无跨膜区域的亲水蛋白,在N端具有一段保守结构域;蛋白质二级结构预测显示,OpNAC026蛋白包含54个α-螺旋和12个β-转角。系统进化树分析表明,OpNAC026基因与拟南芥AtNAC026和AtNAM进化关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,OpNAC026基因在无苞芥的各组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理24h、干旱12h、ABA 6h、4℃低温8h处理均可明显诱导OpNAC026基因的表达。研究表明,OpNAC026基因可能参与无苞芥抗逆机制的调控。