朝鲜淫羊藿EkCDPK基因的克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase, CDPK)是在植物抗逆胁迫信号转导途径中起关键作用的酶。该研究采用RT-PCR结合RACE技术,从朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)中克隆获得一个全长2 036 bp的钙依赖蛋白激酶基因(EkCDPK)。结果显示:(1)EkCDPK基因cDNA为1 410 bp,5′-UTR长387 bp, 3′-UTR长239 bp,编码469个氨基酸。EkCDPK蛋白保守结构域N端为S_TKc domain,C端为EF-hand domain,该蛋白具有1个CDPKs典型结构Ser/Thr蛋白激酶活性位点、1个ATP位点、4个Ca~(2+)结合位点、1个跨膜结构域、无信号肽的稳定亲水性蛋白质,二级结构主要由α-螺旋(43.71%)和无规则卷曲(37.10%)构成。(2)系统进化分析表明,EkCDPK与菘蓝CDPK蛋白表现出较高相似性(95%)。(3)实时荧光定量PCR分析表明,EkCDPK基因在根、茎、叶与花组织中均有表达,根中表达量最高,茎次之;干旱胁迫后15 h内表达量显著高于对照组,之后表达量开始下降;盐胁迫5、15和25 h后EkCDPK基因表达量均明显高于对照组。(4)成功构建了pET-28a-EkCDPK原核表达载体,诱导出约50 kD蛋白质,与预测大小一致,表明重组蛋白EkCDPK表达成功,为采用基因工程手段提高朝鲜淫羊藿抗逆性能研究奠定了基础。