大白菜下胚轴离体不定芽高效再生体系的研究

以大白菜的下胚轴为外植体,比较了不同浓度TDZ和6-BA两种细胞分裂素与不同浓度NAA相配合的培养基上不定芽再生的差异,并利用筛选出的高效再生培养基研究外植体苗龄、切段来源、接种方式以及品种对不定芽再生的影响。结果表明:与6-BA相比,TDZ对诱导下胚轴不定芽再生更有效,在M S+TDZ 0.3 m g.L-1+NAA0.5 m g.L-1+A gNO35 m g.L-1的培养基上,下胚轴不定芽再生频率高达87.8%,平均每下胚轴再生不定芽数也达到15.1个;3~5 d苗龄之间的下胚轴不定芽再生能力无显著差异,再生频率均达到80%以上,此后随着苗龄的增加,不定芽分化频率快速下降,苗龄为7 d时再生频率只有51.1%;下胚轴不同切段不定芽再生能力由强到弱表现为:上部切段>中部切段>下部切段;以正插(形态学下端插入培养基)方式接种的外植体不定芽再生能力显著大于反插(形态学上端插入培养基)和平放的;不同品种大白菜下胚轴的不定芽再生能力有一定差异。     

沙田柚茎尖嫁接苗离体培养的研究

对沙田柚茎尖嫁接苗的离体培养进行了研究,结果表明:顶芽在MS 0.5mg/L6-BA上生长较好,成活率为100%,单个外植体平均不定芽数为2.2,但不定芽生长极慢,成苗困难.加入0.2～0.5mg/LIBA,顶芽生长加快,但单个外植体平均不定芽数下降.带有1cm长枳壳砧木的茎尖在MS 0.5mg/L6-BA上可以形成丛芽,单个外植体平均不定芽数为4.5,而且不定芽生长迅速.虽然我们未能诱导外植体不定根发生,但通过试管嫁接可以获得完整植株.     

TDZ高效诱导蝴蝶兰叶片不定芽及植株再生

以蝴蝶兰（Phalaenopsis）无菌幼苗叶片为材料,研究添加TDZ（噻重氮苯基脲）条件下不同基因型、激素组合、叶片大小、暗培养时间对不定芽发生和再生植株的影响。结果表明：在相同培养条件下,不同基因型外植体芽诱导率差异显著,‘红天使’最高,达81.5%,‘汕农姑娘’等2个品种为0,‘满天红’等4个品种为9.2%～34.9%;添加TDZ芽诱导率显著高于6-BA;单独添加TDZ或6-BA芽诱导率显著高于NAA与TDZ或6-BA的组合。叶片越小不定芽诱导率越高;短时间暗处理有利于不定芽的发生。以1～2 cm长叶片为材料、15 d暗处理、在1/2 MS添加3 mg/L TDZ培养基中,‘红天使’的叶片外植体芽诱导率和平均不定芽数分别可达100.0%和18.2个。研究发现,在继代培养中TDZ对芽的伸长有抑制作用。     

辣椒再生体系不定芽发生因素的优化研究

以辣椒(Capsicum annuum L)品种"哈椒一号"为试材,选用无菌苗子叶、下胚轴和带柄子叶为外植体,采用正交设计探讨不同外植体、激素组合和AgNO_2浓度等因素对不定芽分化的影响,筛选出了三种外植体不定芽诱导的最适培养基。试验结果表明:在不定芽的分化中,6-BA与IAA相配合使叶片不定芽分化频率明显提高,BA/IAA的比例对不定芽分化有明显影响。并且6-BA 6 mg/L+IAA 2 mg/L的组合能够达到最高的诱导率。AgNO_3不但显著提高了不定芽诱导的频率,并且还缩短了不定芽的发生时间。另外,三种外植体的不定芽诱导率,带柄子叶最高,其次是子叶,下胚轴最差。最适不定芽培养基:MS+6-BA 6 mg/L+IAA 2 mg/L+AgNO_2 4 mg/L,pH 5.8,最高不定芽分化率达88.2%。     

大车前体外再生体系的建立和优化

大车前不仅有很高的药用价值,在生态学研究方面也是重要模式植物。关于大车前的组培,目前报道很少。我们通过不定芽直接再生和愈伤组织诱导两种途径,建立了大车前（Plantago major L. ‘Giant Turkish.’）的快速高效组培再生系统。完整的成熟种子培养在添加IAA和TDZ的MS培养基中,不经过愈伤的分化阶段,从子叶节的部位产生不定芽,直接不定芽的诱导频率达到100%。在0.2mg/L IAA和1.0mg/L TDZ作用下,培养4～5周后平均每个外植体产生再生芽的数目达到14.6个。对同一个外植体诱导得到的9株再生植株进行的RAPD检测表明,部分植株在DNA水平上发生了变异。以叶片作为外植体,在添加1.0mg/L NAA的MS固体培养基中培养3周后,伤口处形成愈伤组织,产生愈伤的频率平均为98%。愈伤组织在添加4.0mg/L 6BA的MS固体培养基中分化得到再生芽,分化频率为25%,平均每块愈伤产生再生芽2.8个。两种途径得到的再生芽转到1/2 MS培养基上均可生根、长成完整植株,小苗移栽到温室90%能够存活。     

结球白菜带柄子叶外植体不定芽离体再生能力的遗传分析

解析控制植物不定芽离体再生能力的遗传因素,有助于从根本上提高离体培养困难材料的不定芽再生能力,是植物基因工程遗传改良的基础.本研究以结球白菜4个纯合亲本及其杂交后代的带柄子叶为外植体,建立了高频率离体不定芽再生技术.据此我们还对白菜不定芽再生能力进行遗传分析,并开展亲本与后代杂种的离体培养及反应研究,包括对培养基的激素需求,不定芽形成频率,不定芽形成数量,芽形态等系列特征.研究结果表明,杂种与亲本在培养基的激素浓度上有类似需求;杂交后代的不定芽再生率均至少高于一方亲本,在一些组合中可以高于双亲;在适宜的杂交组合及培养条件下,结球白菜带柄子叶外植体的不定芽再生率可以达100%,每一外植体上的不定芽数达3～7个.方差分析表明,结球白菜的不定芽离体再生能力存在基因的加性效应.     

激素对百合植株再生的影响

本研究设计了 1 5种不同配比的激素组合研究 2 ,4 -D和 6 -BA对百合鳞片叶器官发生和体细胞胚胎发生的影响。结果表明 :在 MS培养基上 ,BA可诱导外植体直接分化不定芽 ,其中 1 .0～ 2 .0 mg/L BA诱导不定芽的分化频率最高 ,6 .0 mg/L BA抑制不定芽分化 ;2 ,4 -D可诱导直接体细胞胚胎发生 ,其中 4 .0 mg/L2 ,4 -D诱导体细胞胚胎发生的频率最高 ,而 6 .0 mg/L 2 ,4 -D诱导体细胞胚胎发生的频率降低 ;当培养基中同时含有 BA和 2 ,4 -D时 ,既出现不定芽 ,又出现体细胞胚。当再生苗移入无激素的 MS培养基和含有 1 .0mg/L和 2 .0 mg/L IAA的 MS培养基上时 ,只有无激素的 MS培养基有利于根的形成。此外 ,鳞片叶的大小和外植体的接种方向也影响外植体分化     

拟南芥不定芽发生早期的数字基因表达谱分析

目前,有关不定芽发生的研究主要集中在单基因的调控方面,缺乏转录组方面的系统研究.利用RNA-seq高通量测序技术在全基因组范围内检测了不定芽发生早期的基因表达谱,共检测到2457个差异表达基因.这些基因参与了激素代谢和信号转导、愈伤组织和侧根的形成、茎顶端分生组织的发育和光合作用等过程.进一步的途径富集分析表明,不定芽发生早期苯丙氨酸代谢和苯丙胺素合成等途径相关的基因显著富集.并且苯丙氨酸可以显著抑制不定芽的发生,暗示了苯丙氨酸代谢和苯丙胺素的合成可能在不定芽发生过程起着重要的作用.     

尾巨桉不同类型愈伤组织抗性相关酶活性差异与不定芽分化关系研究

本实验以尾巨桉无性系32-29无菌苗的茎段为外植体,应用不同植物生物调节剂处理,诱导愈伤组织形成,分别测量4种类型愈伤组织的蛋白质含量及过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等保护酶的指标活性,比较不同愈伤组织的酶活性强弱与不定芽分化的关系。结果表明:不同处理间愈伤组织诱导率差异达到极显著水平,且不同愈伤组织蛋白质含量及3种酶活力差异明显,POD、SOD活力高的愈伤组织不定芽诱导率也高,而PPO含量高的愈伤组织诱芽率低。     

资源植物罗布麻的愈伤组织诱导和植株再生研究

以罗布麻（Apocynum venetum L.）无菌苗的叶、茎和根作为外植体,在不同激素与浓度组合的MS培养基上进行愈伤组织诱导和植株再生研究。结果表明,在多个激素浓度配比的培养基中,罗布麻叶和茎的愈伤组织诱导率均可达到100%;但进一步将愈伤组织转接到含有不同激素组合的培养基进行不定芽分化时,叶和茎来源的愈伤组织的不定芽分化率有很大不同,茎来源的愈伤组织虽可在多个培养基中有不定芽分化,但最高诱导率仅达20%;而叶片来源的愈伤组织虽仅有4个激素组合培养基中有不定芽的分化,但最高分化率可达到35%。因此,构建罗布麻再生体系的最佳外植体应选择叶片。愈伤组织诱导与不定芽分化的最佳培养基均为：MS＋NAA0.1 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L;不定芽在1/2MS＋NAA 0.2 mg/L生根培养基的生根效果最佳,不仅根群质量好,且生根率也高达100%;此再生苗的移栽成活率也最高,在适宜条件下可达75%。     

Activation of mitochondrial promoter P(H)-binding protein in a radio-resistant Chinese hamster cell strain associated with Bcl-2

The cellular response to ionizing radiation is mediated by a complex interaction of number of proteins involving different pathways. Previously, we have shown that up regulation of mitochondrial genes ND1, ND4, and COX1 transcribed from the heavy strand promoter (P(H)) has been increased in a radio-resistant cell strain designated as M5 in comparison with the parental Chinese hamster V79 cells. These genes are also up regulated in Chinese hamster V79 cells VB13 that express exogenous human Bcl2. In the present study, the expression of the gene ND6 that is expressed from the light strand promoter (P(L)) was found to be similar in both the cell lines, as determined by RT-PCR. To test the possibility that this differential expression of mitochondrial genes under these two promoters was mediated by differences in proteins' affinity to interact with these promoters, we have carried out electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using mitochondrial cell extracts from these two cell lines. Our result of these experiments revealed that two different proteins formed complex with the synthetic promoters and higher amount of protein from M5 cell extracts interacted with the P(H) promoter in comparison to that observed with cell extracts from Chinese hamster V79 cells. The promoter-specific differential binding of proteins was also observed in VB13. These results showed that differential mitochondrial gene expression observed earlier in the radio-resistant M5 cells was due to enhanced interaction proteins with the promoters P(H) and mediated by the expression of Bcl2.     

An Escherichia coli expression vector for high-level production of heterologous proteins in fusion with CMP-KDO synthetase

The construction of a vector which overproduces the enzyme, CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyl-transferase (CMP-KDO synthetase or CKS) and its use as an expression vector for producing heterologous proteins in E. coli is described. The vector, which includes a modified lac promoter and synthetic ribosome binding site upstream of the native kdsB gene (encoding CKS), produces CKS at levels as high as 70% of the total cellular proteins. Several heterologous gene sequences have been fused to the 3'-end of the kdsB gene with resulting protein fusions produced at a level of up to 40% of the total cellular proteins.     

农杆菌介导的芥蓝遗传转化体系的建立

采用正交旋转设计方法对影响芥蓝遗传转化体系的因素进行了优化研究,结果表明:影响芥蓝KanR苗率的最主要因素是Kan浓度,而预培养时间和共培养时间是芥蓝遗传转化的主要影响因素。最利于芥蓝遗传转化的操作程序为:将芥蓝无菌苗下胚轴在预培养基上预培养2天后,在LBA4404菌液中感染8min,置于共培养培养基上培养2天,随后把外植体转入含Kan的选择分化培养基上诱导不定芽,28天转瓶一次,当抗性幼苗长至2～3cm时,齐愈伤组织处切下幼苗在生根培养基上诱导不定根,25天左右后等不定根长成即可开瓶炼苗,继而移栽至营养土中,正常管理至开花结果;经PCR、Southern印迹检测,证明CYP86MF基因已经整合至转基因植株染色体中。     

利用RNA指纹技术分析大白菜胞质雄性不育相关基因的差异表达

采用改进的RNA指纹技术(RAP-PCR)对两套大白菜胞质雄性不育材料及其杂种F1花蕾的总RNA进行了分析, 通过对186条随机引物的筛选, 获得4个重复性较好的差异片段S47-412, S93-622, S176-343, S199-904, 并对其克隆、测序。根据各差异条带的测序结果合成长引物进行验证, S47, S93所对应的差异消失, 而S176, S199长引物验证的结果与RAP-PCR相似, 序列分析表明: S176-343, S199-904两差异片段均和油菜Polima不育胞质线粒体基因组orf224/atp6位点有着极高的同源性, 两差异片段序列部分重叠, 这说明两差异片段可能和大白菜胞质雄性不育有很高的相关性。     

Patterns of protein synthesis in dormant and growing vegetative buds of pea

Lateral buds on intact pea plants (Pisum sativum L. cv. Alaska) remain dormant until they are stimulated to develop by decapitating the terminal bud. Using two-dimensional gel electrophoresis, we have examined the protein content of terminal and lateral buds from intact plants and from plants at various times after decapitation. Silver-staining and in-vivo-labeling demonstrated very different sets of proteins. The level of expression of 18 stained and 25 labeled proteins was altered when growth was stimulated; this represents 3.4% and 9.1% of the total proteins detected by each method, respectively. Within 24 h of being stimulated, lateral buds doubled in length and their protein content was qualitatively nearly the same as that of terminal buds. Six hours after decapitation, before the onset of detectable growth, the overall pattern of protein synthesis in lateral buds was more like that of growing lateral buds or of terminal buds than that of dormant lateral buds. Direct application of N⁶-furfurylaminopurine (kinetin) to buds on intact plants stimulated their growth and resulted in the same pattern of protein synthesis as did decapitation. Inhibition of bud growth by addition of indole-3-acetic acid to the stumps of decapitated plants resulted in the synthesis of dormancy-related proteins. Lateral buds at all stages of development incorporated labeled amino acids at similar rates, indicating that metabolic activity is not a component of dormancy in these buds.Abbreviations IAA indole-3-acetic acid - IEF isoelectric focusing - KIN kinetin (N⁶-furfurylaminopurine) - SDS sodium dodecylsulfate - TCA trichloroacetic acid - 2D-PAGE two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis     

Metarhizium anisopliae var. Anisopliae Pr1A基因的克隆表达及抗血清研究

采用RT-PCR方法从本实验室分离筛选到的金龟子绿僵小孢变种Metarhizium anisopliae vat．anisopliae中,扩增得到PrlA基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M．anopliae的PrlA基因(M73795)同源率为98%。以pET- 22b( )为基础载体,构建pET-PrlA重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia．coli)BL 21(DE3)中进行表达。经SDS—PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63．2%。将表达的PrlA蛋白切胶回收后制备成抗原,免疫家兔4次后,采血收集抗血清,用ELISA测定效价为1/10000。结果表明,获得的抗体可用于更进一步的研究,将有利于我们进一步了解M．anisopliaeis的侵染机理,弄清楚各Pr蛋白酶的作用方式和对寄主的选择优势,提高生防控制的有效性。