普那霉素高产相关基因的筛选

普那霉素是由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生的一类临床上应用的链阳性菌素类抗生素.目前,由于对引起普那霉素产量变化的分子机理知之甚少,从而大大限制了利用分子育种技术来大幅度提高该抗生素产量的研究发展.本研究利用限制性内切酶SacⅡ单酶切处理的扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术以普那霉素高产重组菌株为材料进行了抗生素高产相关基因的挖掘研究.以原始菌株ATCC25486为对照,筛选出2个仅在高产菌株中特异扩增的多态性DNA片段.进一步的DNA测序分析和同源性比较表明:1个与抗生素生物合成调控基因afsK具有高度的同源性,GenBank收录号为EU123927;另1个是脱氧核糖核酸外切酶编码基因exoSC的同源片段,GenBank收录号为EU123928.因此,这2个DNA片段是与普那霉素产量变化密切相关的新基因,这2个基因的DNA序列的变异应与普那霉素产量的增加密切相关.本研究从普那霉素高产这一生物表型出发,利用分子标记技术筛选出抗生素高产相关新基因,可进一步从基因变异方面揭示了普那霉素高产的分子机理.     

一种与抗生素调控基因afsk高度同源的新基因——Spy1的克隆

普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素 类抗生素.目前国外对普那霉素的基因工程研究甚少,国内尚属空白,这阻碍了利用基因工程 的方法来提高普那霉素产量的发展.本文通过对普那霉素产生菌——始旋链霉菌柯斯基因组 文库的构建和菌落原位杂交,筛选出了与普那霉素高产密切相关的新基因所在的柯斯质粒,并通过 酶切分析和Southern杂交确定了该基因所在的酶切片段,对酶切片段进行亚克隆测序,获得了 与天蓝色链霉菌中抗生素调控基因afsk同源新基因的全长克隆,该新基因包含有1个2 127 bp的开放阅读框(ORF),编码708个氨基酸的蛋白,命名为Spy1.对该新基因的生物信息学初步分析表明,该基因编码的是丝/苏氨酸蛋白激酶.     

平菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从平菇（Pleurotus ostreatus）8个菌株中筛选出3株高产植酸酶菌株,并根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以平菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约920 bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为919 bp.采用blast进行序列比对,结果表明：该片段与曾报道的源于Trametes pubescens的植酸酶phyA（GenBank Accession：AJ310700）基因相比较,其DNA序列同源性为93%.该片段含有3个内含子,含有植酸酶基因的活性位点保守序列（Active-site sequence）RHGARYPT.     

淋球菌AFLP基因分型的初步研究

采用扩增片段长度多态性技术(AFLP)对奈瑟氏淋球菌菌株进行基因分型研究。以EcoRI和MesI酶切26株淋球菌临床分离株基因组,并进行AFLP分析。同一地区的淋球菌分离株之间存在相当大的DNA多态性。AFLP是鉴别淋球菌临床分离株有用而敏感的基因分型技术,有助于了解流行淋球菌菌株的来源、流行菌株之间的克隆相关性,以及抗生素耐药性菌株的传播情况。     

右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆及其序列分析

以筛选的肠膜明串珠菌的基因组为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增得到右旋糖苷蔗糖酶的基因片段dsr1和dsr2,将基因片段克隆到pUC19载体上并对基因片段组装得到完整基因序列dsrx,通过限制性酶切分析和核苷酸序列分析鉴定,dsrx的序列全长为4,566bp,编码1,522个氨基酸,与GenBank中已注册的U81374核苷酸序列同源性达99％,推导的氨基酸序列与其序列同源性达98．49％。     

普那霉素生物合成相关基因Spr1的功能

以与普那霉素生物合成密切相关的新基因Afsk-like为探针,从始旋链霉菌F618基因组文库中筛选得到含有约8 kb的DNA片段.经测序分析表明,其上含有1个具有1 146个核苷酸的完整可阅读框,该基因被命名为Spr1(HQ450023),推测其编码1个含381个氨基酸的蛋白质产物.经Blastp程序进行分析得知,该基...     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

鸡肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛A基因序列测定和分析

根据GenBank中肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因A(mrkA)GI:149187的序列设计一对引物,以5株鸡致病性肺炎克雷伯菌临床分离株的基因组DNA为模板,PCR分别扩增出了543 bp的Ⅲ型菌毛结构基因(mrkA),经纯化、连接、转化、筛选得到含阳性质粒的菌株,将酶切鉴定正确的阳性质粒菌株进行DNA测序并分析。结果表明所扩增的片段为鸡肺炎克雷伯菌mrkA基因,其开放阅读框架为543 bp,编码181个氨基酸。     

阴道分离因肯毛孢子菌的分子鉴定和种内分型

分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS1)测序,ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法,对三株因肯毛孢子菌Trichosporon inkin进行分子特征及种内分型研究。结果显示,不同菌株的rRNA基因ITS区和IGS1区的序列相似性均高达100%,RFLP酶切图谱具有较理想的种内一致性,而不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明:rRNA基因IGS1区测序及RFLP酶切可考虑用于因肯毛孢子菌的菌种分子鉴定,而基因组DNA的RAPD则较适合于菌种的种内分型。     

海藻糖合酶产生菌筛选、鉴定及目的基因克隆

目的:为筛选出一株产海藻糖合酶的菌株,并以此菌的全DNA为模板,克隆出产海藻糖合酶的目的基因片段。方法:实验过程中采用了常规筛选菌种、快速提取细菌全基因、显微镜观察菌种、热启动PCR技术、电泳纯化回收基因片段、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段等方法。结果:在电镜下可观察到有芽孢、杆菌;菌株16S rRNA基因扩增产物共计1490个碱基;PCR方法扩增出阳性克隆大约1700bp的基因片段。结论:通过生理、形态、结构特征分析及16S rRNA基因全序列比较得出结论:筛选到一株短小芽孢杆菌;PCR扩增出阳性克隆片段,全长1722bp,为实验所要的编码海藻糖合酶的基因片段。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株单加氧酶基因的克隆与表达

构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株荧光素样单加氧酶基因表达克隆载体,并进行融合表达。PCR扩增出嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA中包含单加氧酶基因约1300bp的核酸片段,将其克隆到T载体pMD-18中进行序列测定,所得序列申请并获得GenBank登记号(GQ122330)。DNA star软件分析发现该基因片段中含有一个996bp的完整开放读码框架(ORF),与GenBank中收录的S.maltophilia R551-3(CP001111/GenomeProject17107)和K279a(AM743169)的MO基因核酸序列同源性分别为90%和89%,氨基酸序列同源性分别为93%和90%。根据该ORF序列设计分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的表达克隆扩增引物,PCR扩增、双酶切后将产物亚克隆到pET32a载体中,经过双酶切验证,证实成功获得了表达重组载体pET32a/MO;将其转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导后成功表达出54.2ku的MO融合蛋白,为该酶进一步的功能研究和开发奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中融合表达

以自行分离筛选出的天然枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C-36的染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有内切葡聚糖酶基因的DNA片段,将其克隆到pMD-18T载体中,序列分析表明,克隆得到的DNA片段全长1602bp,编码一个含有499个氨基酸的多肽。与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列比对,其核苷酸同源率为90％～93％,其编码的氨基酸序列的同源性在90％～98％,已将此基因注册GenBank（DQ782954）。将含内切葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用Kpn I和EcoR I双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-32a相连接,并导入大肠杆菌BL21中表达。蛋白质电泳实验结果表明在6．47×10^4处有表达蛋白带。经测定表达蛋白比酶活力达99．02U／mL,为出发菌C-36（63．78U／mL）的1．55倍。     

幽门螺杆菌hpaA基因RFLP研究

用限制性片段长度多态性(RFLP)的方法评价幽门螺杆菌不同菌株鞭毛粘附素基因(hpaA)的变异性。PCR扩增9株幽门螺杆菌710bp的hpaA基因,用Hha Ⅰ、HaeⅢ限制性内切酶对该基因片段进行酶切分析。hpaA基因HaeⅢ单酶切可见4种带型,HhaⅠ单酶切出现5种带型。从临床分离的H.pylori菌株hpaA RFLP互有差异,且不同于国际标准菌株;临床分离株感染动物后分离得到的动物适应株其hpaA基因也发生了变异。不同H.pylori菌株间hpaA基因表现出明显的多态性,为开展H.pylori的分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组DNA经Sau3 AI不完全酶切。回收20-30kbDNA酶切片段,与经Hpal和BamHI酶切的粘粒载体pKC505进行连接,将连接产物用噬菌体包装蛋白包装。侵染大肠埃希菌DH5α。在舍有安普霉素的LB平板上培养,所得转化子数为12000个,构建成不吸水链霉菌梧州新亚种的基因组文库。以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99％的基因组,达到了建库要求的理论值。未扩增文库的滴度为1．2×10^8pfu／L,扩增文库的滴度为4．8×10^11pfu／L,包装效率为每微克DNA1．2×10^5个转化子。随机挑取菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆及其序列分析*

以筛选的肠膜明串珠菌的基因组为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增得到右旋糖苷蔗糖酶的基因片段dsr1和dsr2,将基因片段克隆到pUC19载体上并对基因片段组装得到完整基因序列dsrx,通过限制性酶切分析和核苷酸序列分析鉴定,dsrx的序列全长为4,566bp,编码1,522个氨基酸,与GenBank中已注册的U81374核苷酸序列同源性达99%,推导的氨基酸序列与其序列同源性达98.49%。     

斑马鱼Gfi1.1基因的克隆及其体外转录

目的:克隆斑马鱼Gfi1.1基因的全长cDNA,运用T7 RNA聚合酶对含有Gfi1.1基因的ORF区进行体外转录,在体外合成5端带有帽子结构的Gfi1.1 mRNA分子,为后续研究斑马鱼Gfi1.1基因的功能打下基础。方法:应用RT-PCR从斑马鱼组织中扩增出Gfi1.1 cDNA片段,经回收纯化与pGM-T载体连接并转化感受态细菌DH-5α,通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落,小量提取质粒,Nde I限制性内切酶线性化pGM-T-Gfi1.1质粒,运用T7 RNA聚合酶对Gfi1.1基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得约1.2 kb的DNA片段,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM_001020776)一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-Gfi1.1,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。结论:成功克隆斑马鱼Gfi1.1基因并体外转录及加帽pGM-T-Gfi1.1。     

1株虎源致病性肠球菌的分离鉴定及序列分析

从病死老虎肺脏中分离到1株肠球菌,并对该菌做了生理生化鉴定、药敏试验,致病性试验。本菌对多种抗生素高度耐药,对小白鼠有强致病性,其LD50为2.7×109.2cfu。并用PCR方法扩增分离菌株16S rDNA基因,获得1 415 bp片段,该片段核苷酸序列提交GenBank,登陆号为HM346186,将分离株的16S rDNA核苷酸序列与GenBank上其他肠球菌进行同源性分析。结果表明,分离株的16S rDNA核苷酸序列与肠球菌(EU285587)的同源性为100%,因此该分离菌株被鉴定为致病性肠球菌,命名为YN-1株(云南-1株)。     

异源表达afsRScla全局性调控基因提高工业菌株纳他霉素产量

前期研究表明棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla异源表达可以激活变铅青链霉菌中两种抗生素的合成。本研究将包含afsRScla基因的质粒pHL851整合到纳他霉素工业生产菌株褐黄孢链霉菌TZ1401的基因组中,使纳他霉素产量提高38%,达到3.56g/L。qRT-PCR检测6个纳他霉素生物合成基因的转录情况,发现其转录水平提高1.9-2.7倍,表明afsRScla通过正调控纳他霉素生物合成基因的转录,从而提高纳他霉素的产量。本研究结果对afsRScla在抗生素工业生产菌株的高产育种应用具有借鉴意义。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。