农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的定点敲除技术在红色红曲菌中的应用

红曲菌(Monascus spp.)是一种重要的丝状真菌, 广泛应用于食品和医药领域中。目前, 由于对红曲菌遗传背景了解的很少, 因而对其重要功能基因的研究报道很少。本研究采用根癌农杆菌介导的转化技术对红色红曲菌(Monascus ruber)中推断的G-蛋白信号调节子mrfA基因的RGS功能域进行定点缺失研究, 探讨基于同源重组为基础的基因定点缺失技术在红曲菌基因功能鉴定中的可行性。构建的敲除载体pC805S左右同源臂长度分别为958 bp和824 bp, 将其转入受体菌M. ruber 中, 得到的138株转化子中, 有26株转化子发生了同源重组, 重组率达到18.8%。实验结果表明该技术作为红曲菌基因功能鉴定的方法是可行的。     

红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选

以农杆菌介导法建立的红曲霉T—DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0．04～154．57μg／g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测

根据沙门菌invA基因、大肠杆菌phoA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因序列,设计3对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果表明3对引物能特异地扩增出284bp、622bp、484bp的目的条带;最佳反应条件为沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的引物浓度分别为40nmol／L、40nmol／L、80nmol／L,Mg^2＋浓度2．4mmol／L,dNTP浓度2001μmol／L,Taq DNA聚合酶1.5u,退火温度55．0℃-57．4℃之间;在此条件下多重PCR同时检测DNA的敏感性分别是10．2pg、10．2pg、102．0pg,检测时间4h。建立的多重PCR是一种敏感、特异、准确、快速的方法,为同时检测食品中沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

CRISPR-Cas系统及anti-CRISPR蛋白在微生物中的研究进展

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISP) and CRISPR associated proteins)系统是细菌用来防御病毒、质粒等外源核酸入侵的一种获得性免疫防御系统。随着研究的深入,CRISPR-Cas系统已发展为一种重要的基因编辑工具,并成功应用于动物、植物和微生物的基因改造中。但该基因编辑方法有时存在基因脱靶效应,从而限制了其推广应用。最近,通过将1种新发现的抗CRISPR蛋白(Anti-CRISPR protein,ACP)与CRISPR-Cas系统相结合,已成功开发出可控制基因脱靶效率的CRISPR-Cas基因编辑工具。本文首先对CRISPR-Cas系统及ACP进行了简要介绍,然后就CRISPR-Cas基因编辑工具及ACP在微生物基因改造的应用现状进行了综述,并对ACP介导的CRISPR-Cas基因编辑方法(ACP-CRISPR-Cas)在微生物基因编辑中的应用前景进行了讨论。     

右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆及其序列分析

以筛选的肠膜明串珠菌的基因组为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增得到右旋糖苷蔗糖酶的基因片段dsr1和dsr2,将基因片段克隆到pUC19载体上并对基因片段组装得到完整基因序列dsrx,通过限制性酶切分析和核苷酸序列分析鉴定,dsrx的序列全长为4,566bp,编码1,522个氨基酸,与GenBank中已注册的U81374核苷酸序列同源性达99％,推导的氨基酸序列与其序列同源性达98．49％。     

右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆及其序列分析*

以筛选的肠膜明串珠菌的基因组为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增得到右旋糖苷蔗糖酶的基因片段dsr1和dsr2,将基因片段克隆到pUC19载体上并对基因片段组装得到完整基因序列dsrx,通过限制性酶切分析和核苷酸序列分析鉴定,dsrx的序列全长为4,566bp,编码1,522个氨基酸,与GenBank中已注册的U81374核苷酸序列同源性达99%,推导的氨基酸序列与其序列同源性达98.49%。     

TAIL-PCR法快速分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点侧翼序列

采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增到了长度介于500bp～1300bp之间的7个DNA片段,对这些DNA片段测序,并采用生物信息学方法对测序结果进行了分析,表明其中有1个片段与烟曲霉Af293发育调控子flbA的相似性较高。TAIL-PCR法成功应用于分离红曲霉突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,为大规模获取插入位点侧翼序列建立了可行的方法,也为进一步研究红曲霉功能基因奠定了基础。