乳酸乳球菌组成型表面展示载体的构建及鉴定

目的探索融合有Usp45信号肽和3Lys M锚定序列的EGFP蛋白能否通过p32启动子组成型展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法融合PCR法分别将p32启动子与Usp45信号肽、3Lys M与egfp基因融合亚克隆至p MD-18T载体,鉴定正确后命名为18T-p Usp45、18T-3Lys M-egfp,分别将上述片段切下依次插入p MG36e构建p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp。将其转化入乳酸乳球菌MG1363,荧光显微镜观察及SDSPAGE、Western-blot检测。结果成功构建重组菌p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp/MG1363,荧光显微镜、SDSPAGE和Western-blot检测表明重组蛋白能在MG1363中组成型表达,且分泌至胞外并锚定在细胞壁上。结论成功地构建了组成型表面展示载体p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp,重组蛋白能分泌至胞外且展示在MG1363细胞壁上。     

宿主菌抗噬菌体机制的研究进展

噬菌体又称细菌病毒,是公认最丰富的微生物,也是最多样性的,这种多样性是适应所面对选择性压力例如普遍存在宿主菌的噬菌体抗性机制。噬菌体通过6步(吸附、注入、复制、转录翻译、组装和释放)侵入细菌并使之裂解,但是当噬菌体感染细菌,就会面临细菌抗噬菌体的机制,宿主菌能够进化出多种抗噬菌体的机制来避免噬菌体的侵染和裂解。本文就对宿主菌抗噬菌体各种机制作一综述。     

幽门螺杆菌hpaA基因RFLP研究*

用限制性片段长度多态性 (RFLP)的方法评价幽门螺杆菌不同菌株鞭毛粘附素基因(hpaA)的变异性。PCR扩增 9株幽门螺杆菌 710bp的hpaA基因 ,用HhaⅠ、HaeⅢ限制性内切酶对该基因片段进行酶切分析。hpaA基因HaeIII单酶切可见 4种带型 ,HhaI单酶切出现 5种带型。从临床分离的H. pylori菌株hpaARFLP互有差异 ,且不同于国际标准菌株 ;临床分     

CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

以CAT(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收(500~1 500 bp)片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素(10μg/m L)和卡那霉素(50μg/m L)双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。     

甲型副伤寒杆菌抗噬菌体及生物膜形成基因的筛选及鉴定

细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)与大部分的细菌感染相关,有助于病原菌抵抗外部不利的环境,包括抗生素和抗噬菌体等.为了研究生物膜和抗噬菌体的作用机制,本文以6株抗噬菌体甲型副伤寒杆菌(副甲菌)突变菌作为研究对象,在Rif+(利福平)(200 mg/L)平板中划线并滴加噬菌体验证能否抗噬菌体,将6株突变菌接种于96孔板中,每组3个重复,观察其成膜能力以及生物膜的形态,定点突变和互补实验验证突变菌的噬菌体抗性是否由突变基因所引起.结果显示:划线平板中野生型副甲菌在滴加1.2×106个噬菌体处出现空缺,而6株突变菌在滴加2.4×109个噬菌体后仍能生长,表明6株突变菌具有抗噬菌体特性;6株突变菌中,σ-54依赖的翻译调节器突变菌成膜能力(A595=1.1±0.2)较野生型副甲菌(A595=0.5±0.1)显著性增强,且差异显著(P0.05),光学显微镜下菌体聚集成粗大的不规则团块;同源重组敲除野生型副甲菌σ-54依赖的翻译调节器,突变菌出现噬菌体抗性,将表达σ-54依赖的翻译调节器的载体转化该突变菌,突变菌又恢复了噬菌体敏感性.结果表明,σ-54依赖的翻译调节器是抗噬菌体和生物膜形成相关的基因.     

幽门螺杆菌hpaA基因RFLP研究

用限制性片段长度多态性(RFLP)的方法评价幽门螺杆菌不同菌株鞭毛粘附素基因(hpaA)的变异性。PCR扩增9株幽门螺杆菌710bp的hpaA基因,用Hha Ⅰ、HaeⅢ限制性内切酶对该基因片段进行酶切分析。hpaA基因HaeⅢ单酶切可见4种带型,HhaⅠ单酶切出现5种带型。从临床分离的H.pylori菌株hpaA RFLP互有差异,且不同于国际标准菌株;临床分离株感染动物后分离得到的动物适应株其hpaA基因也发生了变异。不同H.pylori菌株间hpaA基因表现出明显的多态性,为开展H.pylori的分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

带锚定基序3LysM的EGFP融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示

目的探索融合有锚定序列的EGFP蛋白,能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法采用融合PCR方法扩增带有锚定序列的egfp(3LysM-egfp),亚克隆至pMD18T载体,测序正确后,插入表达载体pET28a转化BL21(DE3)进行诱导表达、纯化,将纯化的3LysM-EGFP与乳酸乳球菌进行体外混合作用,荧光显微镜及Western-blot检测展示效果。结果成功构建表达重组菌pET28a-3LysM-egfp/BL21并诱导出可溶性3LysM-EGFP,纯化后蛋白纯度达到81.5%,荧光显微镜及Western-blot均检测到展示的目的蛋白。结论纯化后的3LysM-EGFP能在体外条件下展示在乳酸乳球菌表面。     

基于Profinity eXact系统的可溶性egfp表达和纯化

为研究Profinity eXact系统在蛋白表达及纯化过程中的效果,利用PCR扩增绿色荧光蛋白基因egfp,定向克隆至表达载体pPAL7上,转化BL21(DE3),荧光显微镜下观察诱导后的重组菌;取超声破碎的上清挂柱纯化,紫外下检测纯化后egfp发出荧光的特性,Western blot分析其免疫反应性。结果表明:诱导后的重组菌pPAL7-egfp/BL21(DE3)在紫外光下能够发出绿色荧光;一步纯化后的egfp蛋白同样也能在紫外激发下发出绿色荧光,同时egfp蛋白能和特异性抗体结合,具有良好的免疫反应性。实验结果说明Profinity eXact系统对于可溶性蛋白的表达和纯化,方法操作简单、快捷,具有很好的应用价值。