重组定点突变巴曲酶质量标准研究

目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定.     

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线。通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(his4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化。从每升发酵液中可纯化得到10mg重组巴曲酶,其比活为238NIHunits/mg,分子量为30.55kD。重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间。为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础。     

定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达

目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性.     

天然巴曲酶的酶学性质研究

目的 研究巴西矛头蝮蛇蛇毒中纯化的天然巴曲酶的酶学性质.方法 测定不同的温度、pH值和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响.结果 实验表明,该酶在温度30～40℃,pH 6.5～9.0活性较为稳定;其最适反应温度为37℃,pH为7.5;Mg2+、K+和Ca2+离子对酶活有激活作用,而Cu2+、Fe2+和Zn2+离子对该酶有抑制作用.结论 从蛇毒提取的天然巴曲酶酶学性质比较稳定.     

重组定点突变巴曲酶酶学性质研究

目的对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究,为开发成临床用药奠定基础。方法测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响。结果重组定点突变巴曲酶的最适pH值在6．5～7．5之间。该酶在50℃以下活力保持90％以上,但当温度超过60℃时,该酶已完全失活。Ca^2＋和Na^＋离子对酶的稳定性无明显影响,而Mg^2＋、K^＋、Mn^2＋离子则表现为激活作用,Zn^2、＋Cu^2＋、Fe^2＋、Co^＋离子则表现为明显的抑制作用。结论重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定,它不耐高温,金属离子对其活性有一定的影响。     

立止血的酶学特性及其作用机理

立止血是从蛇毒中分离得到的、以止血作用为主的酶制剂。其中含有两种成分 :巴曲酶 ( Batrox-obin) ,亦称巴特罗酶 ( Batroase)、爬虫酶( Reptilase) ,及微量的凝血因子 脂依赖性激活剂( Phospholipid- depending Factor X Activator,FXA,简称 因子激活物 ) [1,2 ] 。由于立止血具有速效、高效、长效、安全、方便且不受血浆凝血酶抑制剂影响的诸多优点 ,因而广泛用于治疗和预防各种出血性疾病。本文将就其酶学特性及作用机理作一综述。1　酶学特性1 .1　巴曲酶的基本酶学特性　　立止血中的巴曲酶为类凝血酶 ,是单链的糖蛋白 ,可由数…     

巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

目的研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达。方法按Pichiapastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZaA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33。筛选鉴定转化子．经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶。经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33．0 kDa．免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性。结果经发酵条件的优化．发酵罐的表达量达到25000Ku／L发酵液。从每升发酵液中可纯化出11．0mg重组巴曲酶。结论巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建．为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础。     

竹叶青蛇毒凝血酶样酶氨基酸序列报道

蛇毒凝血酶样酶可作为蛋白酶结构与功能研究的良好模型,并已广泛用于各种血栓疾病的诊断和治疗,因而测定其一级结构具有重要意义．利用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出竹叶青蛇毒凝血酶样酶（ＴＳＶ－ＴＥＬ１）的ｃＤＮＡ;将扩增的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,经末端终止法测定核苷酸序列,推导出竹叶青蛇毒凝血酶样酶的全序列．竹叶青蛇毒凝血酶样酶由２３４个氨基酸组成并含有１个位于Ａｓｎ２０的Ｎ－型糖基结合位点．竹叶青蛇毒凝血酶样酶序列与其它蛇种来源凝血酶样酶具有较大相似性,其与黄绿烙铁头蛇毒凝血酶样酶序列相似度为８４％,与美洲矛头蝮蛇毒凝血酶样酶序列相似度为６８％,而与牛凝血酶Ｂ链序列相似度仅为２５％．     

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的 建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法.方法 从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针.此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应.结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均＜10 ng.结论 该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测.     

毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。结果表达温度在25℃,pH值为7．0,加入甲醇的量为10g／L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84-96h。结论重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。     

蛇毒检测技术研究进展

毒蛇咬伤仅从临床表现判断蛇种 ,常会误判 ,导致患者不能得到及时而正确治疗 ,因此 ,快速、准确的检测方法对判断蛇咬伤的蛇种是很重要的 ,而目前蛇毒的检测方法有生物检测法、免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫测定法、凝集测定法、荧光免疫测定法、酶联免疫吸附测定法等。而酶联免疫吸附测定法在专一性、敏感性、快速性、方便性方面取得了很大的进步 ,可用于野外检测。放射免疫测定法则运用于抗蛇毒 X因子的单克隆抗体 MP2来检测病人体液中的鲁塞尔蛇毒 ,这种方法的灵敏度在尿液中为 4ng/ml,在小牛血清白蛋白 -磷酸盐缓冲液中为 2 0 ng/…     

蕲蛇酶注射液治疗急性脑梗死Ⅱ期临床研究总结

蕲蛇酶注射液治疗急性脑梗死Ⅱ期临床研究总结赵玉宾李美琳曹美英慕容慎行季晓林蕲蛇酶注射液含有从蕲蛇毒中分离获得的三个类凝血酶同功酶。临床前实验证明,本品具有抗血小板聚集、降低血浆纤维蛋白原含量,延长部分凝血活酶时间,对抗动物实验性脑血栓及动静脉血栓的效...     

酶标抗原火箭免疫电泳法及其在蛇毒抗原成分含量测定中的应用

为解决目前蛇毒成份检测困难以及寻找一种可用于蛇伤快速鉴别诊断的方法,本研究建立了酶标抗原火箭免疫电泳法。本法结合了酶标法灵敏度高和火箭电泳操作简单的特点,对待测的同种抗原标记辣根过氧化物酶(酶标抗原),检测时把微量的酶标记抗原掺入被测样品中,在含多价抗血清的免疫电泳板进行电泳。最后用辣根过氧化物底物3.3′-二氨基联苯胺在板上直接显色,显色后观察到的免疫沉淀线高度与被测抗原含量呈正相关(r=+0.98)。采用本方法检测眼镜蛇毒细胞毒素和限镜王蛇毒 L-氨基酶氧化酶,细胞毒素的最低检测浓度为110ng/ml,氨基酸氧化酶为60ng/ml。比单向火箭免疫电泳法灵敏度高30倍。用同一原理的酶标记抗原融合电泳法监测L-氨基酸氧化酶的层析分离时,比酶活性法检测灵敏度高20倍。全部检测只需30分钟。初步观察商品眼镜蛇毒抗血清可对蛇毒15种成分产生免疫沉淀线,眼镜蛇的细胞毒与同科异科蛇毒的细胞毒素无交叉免疫反应。因此,采用本法可以确定不同蛇种蛇毒中所含的特异性抗原,获得蛇伤鉴别诊断的依据。     

Val22对恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶催化活性的影响

恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶的Val22位于20 s环状结构上, 是与底物结合相关的氨基酸之一。其中Val被替换为Arg后酶活性下降了75.9%。除了酶与底物疏水作用减弱以外, 静电排斥作用增强也可能引起活性的下降。利用分子动力学模拟对酶与底物的米氏复合物进行分析, 结果表明: 突变后第22位氨基酸侧链与底物的静电势从0.036 kJ/mol升高至0.124 kJ/mol。这说明氨基酸侧链极性的改变增加了侧链与底物分子之间的静电排斥作用, 因而静电排斥作用也是导致突变体活性下降的原因之一。同时, 突变后系统势能增加了283 kJ/mol, 进一步证实了第22位氨基酸侧链极性和带电性质的改变导致酶与底物结合状态的势能增大, 从而引起活性大幅下降。因此, 将来对酶的结合口袋区域进行理性设计时, 除了考虑空间位阻效应外, 还需考虑疏水作用和静电作用。     

蛇毒的生物化学(续)——蛇毒对血液和心血管系统的作用及临床应用

以前曾综述了蛇毒神经毒素、膜活性多肽以及蛇毒酶的有关研究资料,本文将着重介绍作用于血液和心血管系统的酶和蛋白质的生物化学性质及其在临床上的应用。一、蛇毒对凝血系统的作用蛇毒对凝血系统的作用早已为人们所注意,两百年前,把蛇毒分成促凝和抗凝两大类,但实际上许多蛇毒同时兼有这两类活性。蛇毒对凝血系统的作用可以归结为图1。1.蛇毒的促凝作用蛇毒的促凝作用主要表现为凝血酶样作用、凝血酶原激活作用和第X因子激活作用。     

蛇毒纤维蛋白（原）溶解酶的研究进展

蛇毒纤溶酶能直接溶解纤维蛋白（原）,具有作为强力溶栓剂的潜在价值。对蛇毒纤溶酶的深入研究,不仅有助于阐明蛇伤中毒患者的凝血病理机制,而且为其开发应用提供了理论基础。文章综述蛇毒纤溶酶的研究进展及应用前景,重点阐述其分子结构、酶学特性及其与出血活性的关系     

蛇毒凝血组分促凝机制及其应用研究进展

蛇毒中含有许多不同生物活性的酶类。其中在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能作用于血液凝固酶促级联反应过程中的一个或多个环节的酶,可激活FV、FVⅡ、FIX、FX、FⅡ或直接使纤维蛋白原凝集(类凝血酶)的凝血组分。自从1976年Kisiel等从Russell’s viper中分离到FX     

蛇毒抗栓酶研究进展

本文对蛇毒抗栓酶抗栓作用原理、国内外研究概况、国内生产、研制和质量控制情况进行了详细介绍。根据我们抽检的１８个生产厂家的９３批成品、半成品质量情况,发现在安全、有效和制品纯度方面都存在着较突出的质量问题,有效成分类凝血酶的活性检查是国际上通用的检查指标。我国的地方法规和生产厂家内控质量都未列入该项检查。我们从９３批制剂中只查到６７．７％类凝血酶阳性,没有类凝血酶活性的制品,与我们查到的江浙蝮蛇毒中不含类凝血酶相关。对天然蛇毒的研究,作者建议向综合利用的研究方向发展。     

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化

根据同源性分析设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,之后将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中.经筛选得到甲醇快速生长型转化子His+Mut+在500 ml摇瓶中培养,甲醇诱导分泌表达.上清液中重组类凝血酶是通过两步柱层析得到:Q Sepharose FF和Benzamidine-Sepharose 4BCL.与天然蛇毒类凝血酶一致,分泌表达的重组类凝血酶具有较强的酯酶活性,但精氨酸甲酯如TAME的水解活性较弱.此重组类凝血酶在37℃中性溶液中保存过夜将分解成小肽,但在0℃下很稳定.该酶的最适pH为8.0.     

五步蛇毒中低分子量蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 寻找五步蛇毒新的蛇毒类凝血酶组份。方法 用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（－ＦＦ）,ｃｍ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ纯化经常规化学提纯的五步蛇毒;以血凝活性和精氨酸酯酶活性（ＢＡＥＥ）检测酶活力;以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳法测定分子量。结果 得到分子量为１４０００左右的电泳纯蛇毒类凝血酶组份。结论 五步蛇毒中含有低分子量蛇毒类凝血酶。