禾本科psbA-trnH基因的序列分析及其在斑点野生稻鉴定中的应用

通过对稻属(Oryza L.)及其近缘种等禾本科(Gramineae)植物叶绿体psbA-trnH基因进行扩增和测序,分析其系统进化关系及序列差异,并设计鉴定斑点野生稻(O.punctata)的特异分子标记。序列分析的结果表明,栽培稻材料间psbA-trnH基因序列没有或很少存在碱基差异,野生稻相对变异丰富,其中靠近3′端下游序列碱基变异较为丰富,5′端相对保守。根据斑点野生稻psbA-trnH基因序列的特异位点设计的引物,扩增的目的片段ptBD118长118bp,退火温度在62℃时特异性最佳。在条码基因差异位点分析的基础上,开发的特异分子标记用于物种的快速鉴定,为珍贵物种的口岸鉴定提供了检测方法。     

扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元的克隆及序列分析

3头扬子鳄血样取自宣城安徽省扬子鳄繁殖研究中心。利用一对简并引物对MHCⅡ类B基因第二外元的部分片段进行扩增;通过克隆、单链构象多态性分析、测序,并将测得序列与下载的8个物种MHC序列比对,确定序列差异和变异位点;利用MEGA软件构建NJ树,PAUP4．0构建MP树。结果得到10种不同的序列,片段长166bp。核苷酸序列中有38个变异位点,氨基酸序列中有23个变异位点;推定的抗原结合位点非同义替换(dN)明显高于同义替换(dS)。10种序列的NJ树和MP树极为相似,均为A、B两个分支,两个分支明显的特异性位点核苷酸序列中有9个。氨基酸序列中有7个。表明扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元有较高的多态性,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。     

基于叶绿体单倍型的山东丹参居群遗传结构分析

依据叶绿体psbA-trnH基因间隔区的序列多态对来自山东地区丹参的3个自然居群和1个栽培居群进行了遗传结构研究.结果显示,80个供试材料中共有10种单倍型,核苷酸多样性为0.024,叶绿体DNA单倍型进化分支分析把10种单倍型分为2大支,但每支都由4个居群的单倍型共同构成;Nei多样性指数为0.284,Shannon信息指数为0.406,多态位点百分比率为70%;4个居群总基因多样性为0.905,居群内平均基因多样性指数为0.747,遗传分化系数为0.175;不同居群间的遗传分化系数为0.017～0.199,基因流为2.013～28.912;AMOVA分析揭示居群间只有5%的遗传差异.研究结果表明,山东丹参遗传多样性水平较高,但由于彼此较高的基因交流,居群间遗传分化水平低,仅有的遗传差异主要存在于居群内;另外,序列谱系关系分析表明山东栽培丹参来源复杂且具有丰富的遗传多样性.     

苦马豆叶绿体基因组结构及其特征分析

利用Illumina高通量测序平台对苦马豆（Sphaerophysa salsula）进行测序和组装,获得完整的苦马豆叶绿体基因组序列。组装结果表明,苦马豆叶绿体基因组全长123 327 bp,存在IR区丢失,不具有四分体结构;注释结果显示,苦马豆叶绿体基因组共编码108个基因,其中包含74个蛋白编码基因、4个rRNA基因和30个tRNA基因;叶绿体基因组序列上共检测到99个SSR位点,包含75个单核苷酸、17个二核苷酸和7个三核苷酸重复单元;系统发育分析显示,苦马豆和骆驼刺为姊妹群,亲缘关系最近。这为今后苦马豆遗传多样性、群体遗传结构和物种形成机制研究奠定了基础。     

罗氏沼虾不同群体线粒体COI基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）线粒体DNA的COI基因,测定该基因片段序列。分析了罗氏沼虾缅甸原种F1代、江苏养殖群体和广西选育F2代3个群体共17只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态。结果表明,缅甸原种F1代遗传多样性最为丰富,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传多样性相对贫乏。在长度为498bp的基因片段中,共检测到10个多态性核苷酸位点（占2.01%）,17只个体具有5种基因型,3群体各自的平均核苷酸位点差异分别为0.88%、0.07%和0。UPGMA分子系统聚类树显示,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传关系最近,其单倍型混杂聚成一支,而缅甸原种F1群体相对独立为另外一支。COI基因可以作为区分两分支群体的遗传标记。     

秦巴山区漆树nrDNAITS和cpDNA序列分子进化特点的分析

应用PCR产物直接测序法分析漆树种群nrDNA （核糖体DNA） ITS序列和cpDNA序列（matK、rbcL、psbA-trnH）的碱基差异,初步研究两套植物基因组的变异速率。结果表明：nrDNA ITS序列共有518 bp,有变异位点15处,变异位点百分率为2.9%,（G+C）含量为61.8%。cpDNA序列合并后长度1 907 bp,有变异位点20处,变异位点百分率为1.05%,（G+C）含量为36.1%。通过对ITS序列核糖型（Ribotype）和叶绿体序列单倍型（Haploype）进行分析发现,秦巴山区漆树区域性分布明显,不同区域拥有自己独特的单倍型,漆树居群历史近期没有扩张。nrDNA ITS序列较叶绿体序列进化较快,变异速率较快。nrDNA ITS序列及叶绿体matK、psbA-trnH适合漆树的亲缘地理学研究。     

罗氏沼虾3个群体线粒体COⅠ基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)线粒体DNA的COⅠ基因,测定该基因片段序列.分析了罗氏沼虾缅甸原种F1代、江苏养殖群体和广西选育F2代3个群体共17只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态.结果表明,缅甸原种F1代遗传多样性最为丰富,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传多样性相对贫乏.在长度为498 bp的基因片段中,共检测到10个多态性核苷酸位点(占2.01%),17只个体具有5种基因型,3群体各自的平均核苷酸位点差异分别为0.88%、0.07%和0.UPGMA分子系统聚类树显示,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传关系最近,其单倍型混杂聚成一支,而缅甸原种F1群体相对独立为另外一支.COⅠ基因可以作为区分两分支群体的遗传标记.     

藏鸡主要组织相容性复合体B-LBⅡ基因第二外显子序列遗传变异分析

根据鸡主要组织相容性复合体B-LBⅡ基因序列设计特异性引物,在藏鸡基因组中扩增了一个包括其第二外显子和第二内含子在内长度为374 bp的片段,并通过克隆和PCR直接测序获得了该片段的核苷酸序列。发现了15个B-LBⅡ新等位基因。对18个B-LBⅡ等位基因核苷酸序列和其所编码的MHCB-LBⅡ分子β1结构域的氨基酸序列分析显示,第二外显子核苷酸序列遗传多态性异常丰富,存在着62个多态变异位点(共包括80个突变),其中41个为简约性多态位点;衡量该序列遗传多样性的π值为0.0718;反映其群体内遗传变异度的平均遗传距离为0.056±0.008,低于在5个外来品种所估算的平均遗传距离。该编码区核苷酸相对异义替换率(15.61±2.69%)显著高于其同义替换率(3.25±0.94%),进一步分析表明,基因重组和平衡选择机制可能是引起B-LBⅡ基因序列变异的主要因素。在β1结构域氨基酸序列中,存在11个同义替换和27个异义替换;在24个肽结合位点中有12个变异位点;与其他6个中国地方鸡品种和一个外来品种比较发现,有11个异义氨基酸替换仅出现在藏鸡群体中,并被认为与藏鸡的免疫特异性有关,可为鸡的抗病力研究提供分子依据。     

基于rpl16序列分析大百合的遗传多样性及遗传结构

大百合是百合科大百合属一种重要的野生植物资源,本研究采用基因测序法,利用叶绿体DNA rpl16序列对10个大百合居群进行了遗传多样性和遗传结构分析,旨在为其资源保护和开发利用提供理论基础。结果显示:rpl16序列矩阵长度为699 bp,共检测到14个变异位点和12个单倍型,单倍型多态性(Hd)为0.604;总的遗传多样性(HT)为0.660。该居群间遗传变异(71.53%)大于居群内遗传变异(28.47%),说明居群间变异是其居群的主要变异来源;居群间遗传分化很高(Gst=0.677,Nst=0.614,Fst=0.71531),基因流较低(Nm=0.0995)。失配分析结果表明种群在进化过程中曾经历过快速扩张,中性检验支持上述结果:Tajima′s D=-1.74368(P0.05);Fu and Li′s D=-2.69366(P0.05);Fu and Li′s F=-2.79896(P0.05)。研究结果表明:大百合居群遗传多样性较高,居群间存在较高的遗传分化,主要与其生活史特征相关。基于得到的居群遗传信息,建议采取就地保护为主的保护策略。     

中国部分地方鸡种MHC B-G基因第二外显子的遗传多态性

根据鸡主要组织相容性复合体BG基因序列设计特异性引物,在9个中国地方鸡种和1个国外引进鸡种基因组中扩增了包括其第一内含子和第二外显子在内、长度为401bp的DNA片段。经PCRSSCP分型筛选后,对该片段的核苷酸序列进行克隆测序和直接PCR测序及比对分析,发现了31个MHCBG新等位基因;各等位基因主型所含有的亚型数及其在不同品种间的分布极不均衡。第二外显子核苷酸序列和其所编码的MHCBG抗原类IgV结构域氨基酸序列比较表明,在中国地方鸡种BG基因第二外显子的207bp序列中有37个多态性变异位点,其中简约性信息位点29个,单个位点的变异8个;等位基因间的遗传变异范围0.0013-0.1433;各变异位点的核苷酸变异指数0.206-1.462。该编码区核苷酸的异义替换率为9.26%±1.92%,高于同义替换率2.34%±0.90%。所估计的核苷酸转换数和颠换数随着遗传距离的增加而逐渐增加,当核苷酸转换数和颠换数达到平衡后,该片段核苷酸转换数的增加幅度逐渐高于颠换数。在其所编码的类IgV结构域氨基酸序列中,多态变异位点有22个,其中简约性信息位点6个,单变异位点16个;所估测的等电点为8.45,疏水性氨基酸占40.3%,亲水性氨基酸占29.9%;该序列具有明显的疏水性特点。等位基因间的系统发生分析表明,31个BG等位基因分为两个群,相同主型的等位基因首先聚类。本研究为鸡BG基因的免疫功能和遗传进化研究提供了分子依据     

四川裂腹鱼乌江种群mtDNA控制区序列的遗传多样性分析

采用PCR扩增和直接测序法分析了四川裂腹鱼乌江种群32个个体mtDNA控制区的序列差异和遗传多样性.在该种群mtDNA控制区长度为464 bp的同源序列中,共计有9个变异位点,占总位点数的1.94%.32个个体共定义了9种单倍型,单倍型间平均遗传距离(P)为0.0060,单倍型多样度(Hd)为0.768.核苷酸多样性(π)为0.00324,平均核苷酸差异数(K)为1.500.用单倍型间遗传距离构建的NJ分子系统树聚为两个分支.结果提示四川裂腹鱼乌江种群遗传多样性匮乏,保护四川裂腹鱼乌江种群刻不容缓.     

日本牙鲆主要组织相容性复合体DAB等位基因的多态性

根据牙鲆(Paralichthys olivaceus)主要组织相容性复合体(MHC)DAB基因序列设计特异性引物,在日本牙鲆基因组中扩增了包括DAB基因完整外显子2和内含子1在内的长度为408 bp的DNA片段.对该片段克隆测序后,发现了37个MHC-DAB等位基因,各等位基因的频次以及各主型中亚型数目分布都不平衡.在第二外显子273 bp核苷酸序列中有50个位点发生变异,核苷酸多样性PI值为0.0618,在编码的氨基酸序列中存在多态变异位点30个,其中简约信息位点29个,单变异位点1个.非同义替代与同义替代的比率在抗原结合区(PBR)和非PBR编码区分别为10.0和1.62,分析表明正向选择机制可能是产生牙鲆MHC-DAB多态性的主要因素.估计的核苷酸的转换和颠换数随着遗传距离的增加而增加.各等位基因间的系统发生关系表明,19个主型分为两个群.对氨基酸组分和密码子的偏倚性以及分布频率的分析表明各同义密码子的使用频率不均衡.本研究为牙鲆MHC-DAB基因的遗传进化和分子标记辅助育种的研究提供了理论基础.     

莪术基原植物DNA条形码序列的筛选与鉴定

为寻找适用于中药材莪术基原植物鉴定的DNA条形码序列,探索快速高效的莪术基原植物鉴定的新方法,该文首先利用扩增成功率和测序成功率对中药材莪术三种基原植物,9个样本的7种DNA条形码序列(ITS、ITS2、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、rpoB和atpB-rbcL)进行评估,然后利用MEGA6.0软件对获得的高质量的序列通过变异位点分析、遗传距离计算和系统树分析等进一步进行评估,最后将筛选到的DNA条形码序列对未知基原的待测样品进行基原鉴定。结果表明:(1) ITS、ITS2和matK等条形码序列在莪术基原植物中的扩增或测序成功率较低,难以应用于实际鉴定;而psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB条形码序列变异位点信息过少,不足于区分莪术的三种不同基原植物;只有atpB-rbcL条形码序列的扩增和测序成功率较高,容易获得高质量的序列,同时序列长度(642～645 bp)理想,变异位点多(11个),可实现莪术的三种不同基原的区分鉴别。(2)待测样品经基于atpB-rbcL序列构建的系统发育树鉴别为温郁金。综上所述,叶绿体atpB-rbcL序列能够准确鉴定莪术不同基原植物,可以作为中药材莪术基原植物鉴定的条形码序列。     

珍稀濒危飘带兜兰叶绿体全基因组种内变异研究(附录)

飘带兜兰(Paphiopedilum parishii)分布范围狭窄,仅在中国、缅甸、泰国以及老挝有少量分布。近年来,因生境破坏和人为滥采而导致飘带兜兰野生种群极度缩减。为开发种内多态性的分子标记用于保护生物学研究,该研究对飘带兜兰4个野生个体经测序、组装、注释获得的叶绿体基因组序列,与已公布的飘带兜兰2个个体的叶绿体全基因组序列进行比对,分析飘带兜兰叶绿体基因组的种内差异。结果表明:(1)飘带兜兰叶绿体基因组具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构,基因组长度为154 403～154 809 bp,共编码129个基因,包括78个蛋白质编码基因、39个tRNA基因、8个rRNA基因,以及4个假基因。(2)在飘带兜兰6个个体叶绿体基因组中检测到103～107个SSRs(simple sequence repeats)位点,其中21个SSR位点具有多态性。此外,在6个个体叶绿体基因组中还检测到60个长序列重复,包括17～21个正向重复、18～29个反向重复、9～16个回文重复、4～9个互补重复。(3)通过比较6个个体叶绿体基因组序列的核苷酸多样性,共发现70处变异,包括10个SNPs(single nucleotide polymorphism)、60个插入缺失(InDels)。其中,有3个SNP位点发生了非同义替换,导致编码功能基因的氨基酸发生改变; 19个插入缺失多态性较高,具有开发为分子标记的潜力。(4)通过计算核苷酸多样性值(P_i)共发现8个有变异的区域,P_i值为0～0.006 32,其中变异度较大的是rps3-rpl22、trnL-UAC-rpl32、rpoB-trnC-GCA以及ycf4,这些高变区可开发为分子标记用于评估飘带兜兰遗传多样性。(5)系统发生分析结果表明,飘带兜兰6个个体叶绿体基因组序列聚在一起,与长瓣兜兰互为姐妹群。综上表明,飘带兜兰叶绿体基因组的SSRs、长序列重复、SNPs、InDels以及核苷酸序列呈现了足够的种内多样性,可开发成分子标记用于该种的系统演化及保护生物学研究。     

基于cpDNA和rDNA ITS片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系

西南地区青杨派杨树种质资源丰富,可为杨树遗传改良提供珍贵的基因资源,但树种之间形态学差异细微,该研究以山杨作为外类群,测定了西南地区及其他地区杨属青杨派17个种(杂种)共36份样本的3个叶绿体片段(atpF-atpH、trnL-F和matK)和核糖体ITS片段,并对其进行系统发育分析,以探讨西南地区青杨派树种的系统进化关系。结果表明:(1)在所有样本中,3个叶绿体片段atpF-atpH、trnL-F、matK的长度分别为605~634bp、957~1 010bp、819bp,3个片段拼接后的联合序列包含29个变异位点和15个信息位点;ITS片段对齐后的长度为646bp,变异位点19个,信息位点17个。(2)基于叶绿体联合序列和ITS片段的杨属青杨派树种的平均遗传距离分别为0.001 3和0.003 6。叶绿体联合片段的MP和Bayes系统树树型基本一致,青杨派树种可以划分为2组,第1组由青杨、三脉青杨、大青杨和辽杨构成;第2组中的小叶杨、小青杨、川杨、德钦杨、昌都杨、乡城杨、康定杨、西南杨、滇杨和藏川杨不能有效区分,且均与缘毛杨的遗传关系较近。(3)基于ITS的系统树与叶绿体联合片段构建的系统树差异不大,仅在于第2组中的小青杨与小叶杨、川杨等差异明显,与第1组中的树种紧密聚拢。     

日本囊对虾4个地理群体线粒体16S rRNA序列及遗传结构分析

对我国东南沿海日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的4个地理群体广东群体(GD)、台湾群体(TW)、福建群体(FJ)和浙江群体(ZJ)的线粒体16S rRNA基因片段进行PCR扩增,对产物进行测序后分析。经比对获得470bp的核苷酸分析序列,发现了16个变异位点,得到了10种单倍型。广东、台湾、福建和浙江群体的核苷酸多样性依次分别为0.0008、0.0010、0.0051、0.0015,各群体均存在独有的单倍型和共有单倍型。群体遗传距离分析表明各群体间保持着一定的遗传差异,其中福建群体与其他群体之间存在着较远的遗传距离并保持了较高的遗传多样性。另外,利用其423bp的16S rRNA同源序列探讨了对虾科6个属共12种对虾的系统进化关系,囊对虾属与沟对虾属亲缘关系较近聚为一支,其他4个属的10种对虾聚为一支。     

江西野生寒兰居群遗传结构与遗传多样性研究

该研究采用叶绿体基因组片段(petB-petD)和核基因组ITS序列,对分布于江西的寒兰17个自然居群的252个体进行遗传结构与遗传多样性分析,以明确江西野生寒兰遗传多样性水平与居群遗传结构特征,为探寻江西寒兰资源数量锐减以及保护提供理论依据。结果表明:(1)nrDNA ITS序列长度652～658 bp,总变异位点140处,变异位点百分率为21.3%～21.5%,(G+C)含量为58.9%～67.1%。cpDNA序列长度522～529 bp,有变异位点9处,变异位点百分率为1.70%～1.72%,(G+C)含量为32.9%～33.7%。(2)分子方差分析(AMOVA)表明,种群内的遗传变异大于种群间变异,cpDNA片段居群间的遗传变异为40.76%,居群内为59.24%;ITS居群间的遗传变异为28.96%,居群内为71.04%;基因流(N_m)较大,cpDNA片段N_m为1.226 5; ITS N_m为0.726 7。(3)ITS和cpDNA数据失配分析和中性检验均表明江西寒兰野生居群在历史近期经历了扩张事件,nrDNA ITS序列较叶绿体序列进化较快,变异速率也较快。     

普氏野马线粒体DNA D-loop区序列多态性研究

目的:了解中国新疆吉木萨尔野马繁殖中心的普氏野马(Equus przewalskii)遗传多样性及其遗传背景.方法:采用PCR产物直接测序法,对15匹普氏野马线粒体DNA D-loop高变区进行测序分析.结果:测定15个个体的线粒体DNA D-loop高变区15464～15866片段序列402bp.检测到12种单倍型,包括37个多态位点,占全部序列的9.2%,其中转换位点24个、颠换位点20个、转换位点和颠换并存位点8个、缺失位点3个.A%+T%含量(56.1%)高于G%+C%含量(43.9%),平均A含量为28.4%,T含量为27.7%,C含量为29%,G含为14.9%.单倍型间平均遗传距离为0.030,单倍型多态性(h)为1±0.00116,核苷酸多态性(π)为2.90%.15匹普氏野马线粒体DNA D-loop高变区之间平均核苷酸变异率为2.48%.结论:研究表明我国新疆吉木萨尔野马繁殖中心的普氏野马线粒体DNA D-loop区序列存在丰富的多态性.     

红景天线粒体nad7基因内含子2序列测定及其系统发育意义

开展濒危藏药红景天的分子生物学研究, 可以为红景天遗传资源鉴定与保护提供指导。利用线粒体中nad7基因的保守序列设计的引物, 对分布于四川的大花红景天、长鞭红景天和吉林的高山红景天等9份材料进行PCR分析, 发现在所有的红景天材料中均获得约800 bp的扩增产物。进一步对扩增片段进行序列测定, 结果表明该片段除具有53 bp的外显子区外, 其内含子长度均为738 bp, 有9个核苷酸变异位点。将测定序列进行比对和聚类分析表明, 红景天线粒体nad7内含子2序列被单独聚类。而且测定的红景天的nad7 内含子 2序列, 其长度均小于其他高等植物的同源序列, 体现了红景天属植物的该基因区域的特异性, 可能与特殊的生态环境有关。     

梅EST-SSR标记的开发及利用

利用MISA软件对10 123条梅EST序列进行SSR位点查找,得到含SSR位点的序列935条,SSR位点1233个,平均每100条EST序列中含有12.18个SSR位点.2核苷酸、3核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占35.52%和41.36%.设计了40对EST-SSR引物并进行扩增,有24对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中17对引物具有较好的扩增多态性.测序后发现13对引物中有73.08%的片段具有相应的SSR位点,对杏DNA指纹中部分谱带的测序结果也证明了是梅扩增出的相应的SSR位点.根据本研究含有SSR位点的测序结果推算,从梅EST中开发真实SSR位点的数目为901.随机选择13对引物对杏和梅进行DNA指纹构建与遗传多样性分析,结果发现,来源于梅的EST-SSR引物在杏中有很高的通用性,这些引物把梅和杏分成了两大群体,说明他们是遗传差异明显的两种植物.