供体细胞的选择与动物克隆效率研究进展

哺乳动物体细胞克隆经过几年的发展,已取得了很大进展.已有多种细胞被采用并得到了克隆后代.但动物克隆效率仍然很低,供体细胞的选择是动物克隆中的重要步骤.供体细胞的细胞周期、细胞类型、细胞来源和分化程度等方面都可能影响动物克隆的效率.     

体细胞核移植诱导的表观遗传学变化

体细胞核移植技术是指将一个分化的体细胞核置入去核的卵母细胞中,并发育产生与供体细胞遗传背景一致的克隆后代的技术。目前,世界上通过体细胞核移植技术已经产生了许多的克隆动物。但克隆过程中还存在着很多问题,比如,克隆效率太低、克隆个体常伴有表型异常和早亡等,从而使该技术应有的应用潜力不能得到充分的发挥。体细胞表观遗传学重编程的不完全或紊乱是造成核移植诸多问题的主要原因。近十多年来,人们对体细胞核移植后的重编程进行了广泛的研究,其核心内容包括核及核外结构的重塑、DNA甲基化模式的重建、基因印迹和x染色体失活、组蛋白乙酰化模式的重建、端粒长度恢复等,以期能够对其重编程加以人为干预,从而提高动物克隆效率。本文拟对体细胞核移植诱导的重编程研究进展加以综述,希望对体细胞重编程机制的阐明有所启发。     

表观遗传调控在哺乳动物体细胞核移植上的应用研究进展

体细胞核移植也称为克隆,是指将体细胞经显微操作植入到去核的卵母细胞质中,不通过精子和卵子结合,在体外生产出与供体细胞具有相同遗传物质的胚胎以及动物个体。近年来克隆技术不断发展,但其效率依然有待提高,导致克隆效率低下的重要原因之一便是供体细胞核物质表观遗传重编程不完全。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是人们研究最多的两种表观遗传修饰,此外,基因印记、X染色体失活和端粒长度异常修饰状态也受到研究者的关注。因此如何调节和修复植入前克隆胚胎异常的表观遗传学状态对于提高克隆效率有着重要的意义。本综述植入前克隆胚胎存在的异常表观遗传现象,为建立更为高效的体细胞核移植体系提供一定的理论依据。     

核移植与供体细胞

“多莉”羊的诞生是生物界的一个里程碑,它之所以引起如此大的轰动主要是因为它来源于培养的成年绵羊乳腺上皮细胞,这是人类第一次证明分化的体细胞可以被重编程后恢复全能性并最终分化发育成一个动物个体。这说明哺乳动物分化的体细胞核仍具有全套的遗传物质并能够被卵母细胞逆转恢复全能性。然而,关于多莉的供体细胞来源却一直是克隆领域的一个谜。由于体细胞克隆的效率非常低,而用于核移植的供体细胞悬液中往往含有多种类型的细胞,这使得我们很难确切地知道最终获得的克隆动物是来源于哪一种细胞。这种不确定性给我们研究核移植诱导体细胞重编程的机制带来了很大的困难,因此,对供体细胞的研究也是核移植研究领域的一个重要课题,这包括各种组织来源的体细胞是否均可以用于核移植,终末分化的体细胞是否能够用于核移植,组织干细胞是否更有利于体细胞重编程,供体细胞的分化状态是否与核移植的效率有关,死亡的体细胞是否也可以用于核移植等等。本文综述了核移植中与供体细胞相关的最新研究进展。     

哺乳动物体细胞核移植表观遗传重编程研究进展

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)是唯一能赋予体细胞基因组全能性的生殖工程技术,对动物种质资源保存、畜牧业发展和生物医学研究等具有重大意义。尽管该技术已经取得了许多研究进展,但哺乳动物克隆胚胎的发育效率依然很低,严重限制其在畜牧业和生物医学上的应用。导致克隆胚胎发育效率低的主要原因是体细胞重编程错误或重编程不完全,主要表现为:印记基因Xist表达异常、DNA甲基化异常,组蛋白修饰异常等。本文简要介绍了体细胞核移植技术,系统总结了哺乳动物克隆胚胎发育效率低的主要影响因素,以期为提升体细胞克隆效率相关研究与实践提供理论参考。     

体细胞基因打靶-核移植技术研究进展

转基因效率与外源基因表达水平低的现状一直是制约动物生物反应器研究与产业化的主要技术瓶颈。体细胞克隆动物的成功和胚胎干细胞基因打靶技术的逐步完善使得体细胞基因打靶与核移植技术的结合使用成为可能,这就为生产遗传修饰家畜提供了一种新的手段,为动物生物反应器的成功研制提供了新的技术途径。从体细胞基因打靶的载体设计、转染系统的建立、中靶细胞的筛选和鉴定以及培养体细胞寿命等方面阐述了体细胞基因打靶—核移植技术体系的最新研究进展,并对其在异种器官移植、建立动物疾病模型、提高家畜生长性能以及生产药用蛋白等各个领域中的应用前景作了展望 。     

6-DMAP和胚胎干细胞代数对异种重构卵体外发育的影响(简报)

核移植技术已经广泛应用于动物克隆,但是克隆动物的成活率仍然很低。许多克隆胚胎死于妊娠期,少部分能发育到期,正常出生,但多数在出生后由于心肺和消化道的问题,很快就夭折,有些克隆动物有异常表型,如出生时体重和胎盘过大等。研究发现,在同种克隆动物实验中用胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)作为核供体,发育到期的克隆动物比例明显高于体细胞,并且用杂交一代的小鼠ES细胞为核供体,绝大多数克隆仔     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

人-兔异种核移植构建克隆胚的实验研究

“治疗性克隆”是人类最关注的课题之一,而人体细胞核移植是治疗性克隆的基础和前提。异种核移植的方法虽已被引入人体细胞克隆胚的构建,但供体细胞的类型、培养代数及准备方法与其效率之间的关系尚有待探讨。本实验以不同培养代数和不同准备方法的人卵丘细胞、皮肤成纤维细胞和软骨细胞为供体构建了克隆胚,对其发育情况的比较表明,以卵丘细胞为供体时重构胚的体外发育率高于其余二者,差异显著（P〈0．05）;不同培养代数的成纤维细胞克隆胚和不同冷藏天数供体细胞克隆胚体外发育率无明显差异。此外,本实验还尝试用荧光原位杂交法检测所构建的异种克隆胚核遗传物质的来源,结果显示来自人体细胞。本研究表明,人一兔异种核移植构建克隆胚切实可行;体细胞的类型与核移植效率相关;供体细胞的体外培养传代对克隆胚的发育并无影响;而冷藏是一种简便有效的供体细胞准备方法;此外,用FISH方法对重构胚进行核遗传物质的鉴定切实可行。     

体细胞克隆牛产品安全分析

体细胞克隆技术是将已分化的体细胞移到去核的成熟卵母细胞中,通过体外激活和培养,再移植入受体母畜子宫内,繁殖出具有相同基因型后代的一种技术。该技术可以大幅提升繁殖效率,并提供高质、充足和营养丰富的动物食品。近年来,美国、日本和欧洲等国家相继宣布体细胞克隆动物食品可以上市。然而,目前体细胞克隆效率相当低下,即使是出生的克隆动物也往往伴随发育畸形或高死亡率等现象,在对克隆动物发育异常知之甚少的情况下,宣布克隆动物产品上市是否为时过早?以下综述了克隆牛肉、奶及其产品安全。     

家畜体细胞克隆中核重编程机理研究进展

体细胞克隆在绵羊、山羊、牛、猪等家畜中获得了成功,但目前的克隆效率非常低。克隆效率低使家畜体细胞克隆技术在畜牧业生产及其他领域的应用受到极大的限制,问题的根源在于对体细胞克隆中核重编程的分子机理缺乏了解。供体细胞核移入去核的卵母细胞后,必须经过后成表观遗传修饰的重编程,从而恢复供体细胞核的全能性,才能保证重构胚的正常发育及个体的正常生长。本文从移植核的重构、DNA甲基化总体改变、组蛋白修饰、X染色体失活、端粒长度和端粒酶活性恢复、印迹基因及其他与发育相关基因的表达及核重编程的影响因素等几个方面探讨了体细胞克隆中的核重编程机理,为克隆效率提高的方法研究提供理论依据。     

体细胞克隆发展现状、出现问题及解决方法

目前体细胞克隆技术在畜牧业的许多领域都有着广泛的应用,但体细胞克隆效率低下却严重影响了该技术在畜牧业的发展.几乎所有的克隆动物都有胎盘肥大和表观遗传异常现象,这也是制约克隆效率的重要原因.综述了体细胞克隆的发展现状,阐述了体细胞克隆的胎盘肥大和重编程异常现象.并探讨了利用四倍体补偿法改善克隆胎盘肥大和通过对表观遗传基因的调控提高克隆效率的新方法.     

未经休眠处理的体细胞用于异种核移植

自“多莉”诞生以来,在全世界掀起了一场体细胞克隆的浪潮,许多体细胞克隆动物,如小鼠、山羊、牛、猪等纷纷问世。围绕体细胞克隆的供体细胞周期问题,学术界存在两种不同的观点,一是Wilmut等认为体细胞必须经过休眠处理,使细胞停滞在G0/G1期,或者采用以G0/G1期为主的活体细胞作为供体,这是克隆成功的关键,这一方面的报道已有很多。第二是Cibelli等认为不必对细胞作     

我国体细胞克隆牛的研究进展

近年来,由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值,克隆效率成为科学界研究的热点问题。本文对克隆技术的相关影响因素进行了综述,研究表明,不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率,胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明,玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上,讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率,指出体细胞克隆中亟待解决的问题。     

克隆动物研究进展

本文介绍了世界上和中国采用细胞核移植技术克隆动物的研究历史。综述了细胞核移植的程序、方法和影响因素,包括受体卵母细胞的去核、供体细胞核的制备、核移植、激活、受体细胞与供体细胞的融合、重组胚的体内和体外培养以及胚胎移植产生克隆动物。对克隆动物研究和应用前景进行了讨论。近期的研究结果表明,多代克隆可产生大量遗传性相同的动物,不久的将来克隆技术在商业上的应用将成为现实。     

克隆动物研究进展

本文介绍了上世界上中国条用细胞核移植技术克隆动物的研究历史。综述了细胞核移植的程序、方法和影响因素,包括受体卵母细胞的去核、供体细胞核的制备、核移植、激活、受体细胞与供体细胞的融合、重组胚的体内和体外培养以及胚胎移植产生克隆动物。对克隆动物研究和应用前景进行了讨论。近期的研究结果表明,多代克隆可产生在量遗传性相同的动物,不久的将来克隆技术在商业上的应用将成为现实。     

体细胞克隆猪发育异常研究进展

克隆又称体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT),是一种将已分化的细胞重编程恢复全能性而生产与供体细胞基因型完全相同后代的无性繁殖技术。猪的克隆技术具有重要的应用价值,包括扩繁优良种猪、制备基因修饰猪、保护珍贵和濒危猪种以及研究猪体细胞重编程机制。然而,克隆猪存在出生率和初生重低以及死胎率、新生期死亡率和畸形率高等问题,这些都严重影响了克隆猪的应用前景。供体核的表观重编程错误被认为是克隆效率低和胚胎发育异常的主要原因,但是目前大多数研究通过修正表观重编程错误并没有大幅度提高克隆猪的出生率和健康率。本文综述了克隆猪的异常表型、发育异常的原因以及提高猪克隆效率的有效方法,以期为提高克隆猪的成活率提供参考。     

牛朊蛋白基因prnp敲除载体的构建及真核细胞转染

利用正负筛选策略(Positive-negative selection,PNS)对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。将动物的朊蛋白基因prnp敲除,使其不能表达朊蛋白(传染性海绵状脑病的致病蛋白),从而使其具有抵抗Prion病感染的能力。本研究采用正负筛选策略,构建了牛prnp基因的双等位基因敲除载体,经内切酶Sac Ⅱ线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞,分别用600μg/mL G418、200nmol/mL Ganciclovir(GCV)进行正负药物筛选,最终获得了176个药物抗性细胞克隆,进一步采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对细胞克隆进行鉴定,结果表明,其中的9个细胞克隆为中靶细胞,证明牛prnp基因被成功敲除。本研究为牛prnp的敲除提供了可行性依据,并为体细胞核移植生产敲除朊蛋白基因的转基因动物提供供体细胞。     

牛耳成纤维细胞的培养

体细胞克隆是一种新型、高效且极具生产潜力的繁殖技术,在家畜改良和育种工作中前景广阔.在进行持续且大量的家畜克隆生产中,保证取材方便并不影响供体动物健康是十分关键的,只有这样才能使优势供体源本基因不会受到损害.     

体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)是指将高度分化的体细胞移入到去核的卵母细胞中发育并最终产生后代的技术。然而, 体细胞克隆的总体效率仍然处于一个较低的水平, 主要原因之一是由于体细胞供体核不完全的表观遗传重编程, 包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、基因组印记、X染色体失活和端粒长度等修饰出现的异常。使用一些小分子化合物以及Xist基因的敲除或敲低等方法能修复表观遗传修饰错误, 辅助供体核的重编程, 从而提高体细胞克隆效率, 使其更好地应用于基础研究和生产实践。文章对体细胞核移植后胚胎发育过程中出现的异常表观遗传修饰进行了综述, 并着重论述了近年来有关修复表观遗传错误的研究进展。