黄芪甲苷激活TGF-β1/Smad2信号通路诱导骨髓间充质干细胞向周细胞分化的作用研究

目的:观察黄芪甲苷促进大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法:本研究以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,采用全骨髓培养法,从SD大鼠乳鼠(5d-7d)股骨提取原代细胞,体外传代纯化,P4-P5代用于实验。实验分阴性对照组,大鼠BMSCs 15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法:本研究以大鼠骨髓间培养基培养,不给予药物干预;阳性对照组,给予转化生长因子β1(TGF-β1)5 ng/mL干预3天;黄芪甲苷(Astragaloside,Ast)组,给予黄芪甲苷4μg/mL分别干预1 d、2 d、3 d、5 d、7d;阻断剂组,TGF-β1受体阻断剂sb431542预处理后,再加入黄芪甲苷4μg/mL分别诱导1 d、2 d、3 d。实时定量PCR(RT-PCR)检测神经元-胶质细胞抗原2(Neuron-glial antigen 2,NG2)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)信使核糖核酸(mRNA)表达;印迹法(Western blot)检测NG2、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2蛋白表达。结果:经黄芪甲苷诱导刺激后,大鼠骨髓间充质干细胞在mRNA和蛋白水平上,NG2、α-SMA的表达量均升高;Ast 3d组,与阴性对照组和阳性对照组相比,NG2、α-SMA蛋白和mRNA的表达量均显著升高(p0.05)。黄芪甲苷刺激细胞后,TGF-β1/Smad2信号传导通路被激活,从第一天开始,p-Smad2蛋白表达量升高,第3天到达顶峰,随后降低;其中第三天,p-Smad2蛋白表达量显著高于Ast 0d组(p0.01)。加入阻断剂后,黄芪甲苷受到sb431542影响,对细胞的作用减弱,NG2、α-SMA蛋白和mRNA表达量均下调;sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,NG2、α-SMA蛋白和mRNA的表达量显著降低(p0.001)。受阻断剂的影响,黄芪甲苷对TGF-β1/Smad2信号传导通路的作用减弱,前三天p-Smad2蛋白的表达量均降低,sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,p-Smad2蛋白的表达量显著降低(p0.001)。结论:黄芪甲苷具有促进大鼠BMSCs向周细胞分化的作用,其机制与激活TGF-β1/Smad2信号传导通路相关。     

Smad2/3上调促进大鼠梗阻性肾病的纤维化和凋亡

目的观察TGF-β1/Smads信号传导途径对大鼠肾间质纤维化表达的影响.方法 40只Wistar大鼠分为假手术组及模型组.单侧输尿管结扎术式(UUO)建立肾梗阻模型.分别于术后3、6、14和28d处死动物.应用免疫组织化学和流式细胞学技术来检测TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和观察细胞外基质以及细胞凋亡的改变.MASSON染色观察肾间质病变程度.结果与假手术组相比,模型组于术后3d梗阻肾TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3开始升高,细胞凋亡百分率同时升高,I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平亦升高.第6d各项指标水平显著升高.第14、28d升高更加明显(P＜0.01).B3、B6、B14和B28组之间也随天数增加而显著升高(P＜0.01).肾间质病变面积增加显著(P＜0.01).结论在肾间质纤维化中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3及细胞凋亡明显上升,同时I型胶原及α-SMA表达升高及肾间质纤维化程度增加.TGF-β1/Smads信号传导途径在肾间质纤维化形成中可能起着重要促细胞外基质沉积和细胞凋亡的作用.     

黄芪甲苷抑制缺血再灌注诱导的大鼠心肌细胞凋亡

摘要 目的：本研究旨在探究黄芪甲苷（Astragaloside IV,Ast-IV）在缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）大鼠模型中的保护作用,并讨论黄芪甲苷在抑制I/R诱导心肌细胞凋亡过程中的作用。方法：通过左冠状动脉前降支结扎构建I/R大鼠模型;将40只SD大鼠分为4组：假手术组（Sham组）、模型组（I/R组）、黄芪甲苷干预组（Ast组）和黄芪甲苷+LY294002干预组（Ast+LY组）。使用试剂盒测定血清中心脏功能障碍标记物CPK、ALT、LDH和tropornin-T的表达水平;通过HE染色和TUNEL分别检测心肌组织病理学变化和心肌细胞凋亡情况;通过超氧化物荧光探针染色检测细胞内ROS水平;通过ELISA试剂盒测定心肌组织MDA、GSH和GSH-PX含量;免疫组织化学检测SOD2和HO-1蛋白表达水平,分析心肌氧化应激状态;通过Western blot检测PI3K、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS、caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平变化。结果：Ast组大鼠血浆CPK、ALT、LDH和tropornin-T酶活性均明显低于I/R组（P<0.05）。Ast组大鼠心肌纤维断裂,心肌细胞坏死和炎性细胞浸润等病变程度均低于I/R组。Ast组大鼠TUNEL阳性细胞数低于I/R组（P<0.05)。相较于I/R组,Ast组大鼠Caspase3和Bax表达水平均明显下调,Bcl-2和PI3K蛋白表达水平上调,p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值均显著上调（P<0.05）。Ast组大鼠DHE荧光强度显著低于Ast+LY组（P<0.05）。与I/R组相比,Ast组大鼠心肌组织中MDA含量降低,GSH、GSH-PX、SOD2和HO-1表达水平升高（P<0.05）;与Ast组相比,Ast+LY组大鼠心肌组织中MDA含量升高,GSH、GSH-PX、SOD2和HO-1表达水平降低（P<0.05）。结论：黄芪甲苷通过激活PI3K/Akt信号通路,抑制心肌细胞氧化应激反应,从而减少I/R诱导大鼠心肌细胞凋亡,缓解I/R后大鼠心肌损伤。     

糖皮质激素抑制结肠癌细胞增殖和侵袭的作用机制

本研究目的是为了证实地塞米松对结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用,并阐明其中的分子机制。LoVo细胞经不同浓度梯度地塞米松干预,再加入TGF-β1受体抑制剂SB431542阻断TGF-β1信号传导途径,通过MTS分析各组细胞增殖情况,借助Hoechst 33342和Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡率;结合Western blotting对TGF-β1、Smad2和caspase-3蛋白表达情况的检测结果,分析地塞米松诱导结肠癌LoVo细胞凋亡的作用机理。LoVo细胞在1.0 mmol/L和10.0 mmol/L地塞米松干预48 h后,细胞增殖率与对照组相比分别降低32%(p<0.01)和47%(p<0.001),2组细胞凋亡率分别为28%和36%(p<0.001)。Western blotting结果显示,与对照组相比,地塞米松以浓度依赖性方式显著上调LoVo细胞TGF-β1、Smad2和Cleavedcaspase-3蛋白水平(p<0.01),而TGF-β1受体抑制剂SB431542明显下调TGF-β1、Smad2和Cleaved-capase-3蛋白表达(p<0.05)。流式细胞术检测结果表明,SB431542+地塞米松干预组与地塞米松处理组LoVo细胞凋亡率分别为8%和23%(p<0.001)。地塞米松可显著诱导LoVo细胞凋亡,而SB431542能够挽救这一过程,这表明,地塞米松通过TGF-β1/Smad2通路诱导LoVo细胞凋亡。     

胎盘间充质干细胞治疗小鼠烫伤愈合的相关研究

目的:观察胎盘间充质干细胞对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用,探讨胎盘间充质干细胞对烫伤愈合及瘢痕形成的影响。方法:构建小鼠烫伤模型,注射人胎盘间充质干细胞(hPMSCs),荧光显微镜观察小鼠创伤皮肤组织中hPMSCs细胞的存活情况;HE和Masson染色观察小鼠创伤皮肤的变化;Western blot检测观察创伤皮肤TGF-β1、p-Smad3、Smad7、α-SMA、collagen I、Collagen III蛋白表达变化。结果:注射hPMSCs细胞后,小鼠创伤面积逐渐减小,创伤愈合率逐渐增加;hPMSCs细胞分布在小鼠创伤皮肤组织中,存活状况较好。进一步研究发现烫伤模型组皮肤表层细胞受损脱落,真皮层组织疏松,毛囊、皮脂腺等附属器坏死,可见明显的毛细血管扩张,并伴有炎性细胞渗出,同时可见大量的成纤维细胞增生和胶原纤维形成;注射hPMSCs细胞治疗后,病理改变、纤维增生和胶原形成明显减轻;此外,烫伤模型组创伤皮肤组织中TGF-β1、p-Smad3表达明显上调,Smad7蛋白表达明显下调,α-SMA、collagen I、Collagen III表达明显上调。经hPMSCs细胞治疗后,TGF-β1、p-Smad3蛋白表达明显下调,Smad7蛋白表达明显上调,α-SMA、collagen I、Collagen III蛋白表达明显下调。结论:胎盘间充质干细胞可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路,发挥促进烫伤愈合且抑制瘢痕形成的作用。     

血管平滑肌细胞中ERK通路与TGF-β_1/Smad通路的相互作用

目的:探讨血管平滑肌细胞(VSMC)中TGF-β/Smad与ERK信号转导通路是否存在相互调节关系。方法:原代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞,分四组:①对照组,②TGF-β1组,③ERK阻断剂(PD98059)组和④TGF-β1+ERK阻断剂(PD98059)组。分别用Western blot法检测VSMC内Smad2/3、ERK1/2蛋白表达及磷酸化Smad2/3、磷酸化ERK1/2蛋白含量,RT-PCR方法测VSMC中Smad2、Smad3mRNA的表达。结果:①与对照组相比,TGF-β1组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量增多(P0.05),ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P0.05),TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量无差异;与TGF-β1组相比,TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无差异。②各组的Smad2、Smad3mRNA表达无差异。结论:TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA表达水平无影响。     

TGF-β1激活肝星状细胞并促进血管内皮细胞新生血管形成

该研究旨在探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活中的机制以及活化HSCs促进内皮细胞血管新生(angiogenesis)的作用效果。运用q RT-PCR检测α-SMA、Smad2/3、VEGFA和TGF-β1-RI的m RNA水平;Western blot检测α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3、VEGFA和TGF-β1-RI的蛋白质水平;基质胶(matrigel)血管形成实验检测活化HSCs的促人脐静脉血内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管形成作用。TGF-β1作用后的HSCs高表达α-SMA以及经典的TGF-β1/TGF-β1-RI/Smad2/3信号通路下游相关的TGF-β1-RI和Smad2/3等,具备了活化表型并能促进内皮细胞血管新生。结果表明,TGF-β1信号通过经典的Smad2/3通路激活了HSCs,使激活后的HSCs通过分泌VEGFA具备了促进内皮细胞血管新生的功能。     

麦门冬汤加减方对特发性肺纤维化小鼠PI3K/AKT/mTOR通路的调控

摘要 目的：探讨麦门冬汤加减方对特发性肺纤维化小鼠转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、胶原I(Collagen type I, COL1A)表达的影响以及对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用。方法：将120只SPF级ICR小鼠随机分入空白组、模型组、吡菲尼酮组和麦门冬汤加减方组,用博来霉素(5 mg/kg)建立特发性肺纤维化模型,24 h后分别给予相应的药物治疗。吡菲尼酮组和麦门冬汤加减方组小鼠分别灌胃吡菲尼酮和中药麦门冬汤加减方,空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水,各组均连续给药3周(21d)后取材。观察指标：各组小鼠的肺系数;肺组织病理变化;肺组织TGF-β1、α-SMA、COL1A的表达量(免疫组化);肺组织中α-SMA、COL1A、p-PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达量(Western blot);肺组织中TGF-β1、α-SMA、COL1A的mRNA表达量(qPCR)。结果：模型组小鼠的肺系数显著增加,麦门冬汤加减方组肺系数显著降低;模型组小鼠肺组织中有较多炎性细胞浸润,胶原沉积明显,肺泡结构破坏严重,麦门冬汤加减方组小鼠肺组织病理改变较模型组明显减轻,胶原沉积大量减少,肺泡结构逐渐修复;麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、TGF-β1的蛋白表达量显著降低(P＜0.01);麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、p-PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达量显著下调(P＜0.01);麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、TGF-β1的mRNA表达量显著降低(P＜0.01)。结论：麦门冬汤加减方能有效改善博来霉素诱导的特发性肺纤维化,降低α-SMA、COL1A、TGF-β1的表达,可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制上皮间充质转化,减少细胞外基质沉积而发挥作用。     

miR-101a在乙型肝炎病毒相关性肝纤维化患者中的表达及对肝星状细胞的影响

摘要 目的：探究miR-101a在乙型肝炎病毒（HBV）相关性肝纤维化患者中的表达及对肝星状细胞（HSC）的影响。方法：根据肝纤维化程度将HBV相关性肝纤维化患者进行分组（S0组、S1组、S2组、S3组和S4组）,健康受试者作为健康对照组。通过RT-PCR检测肺组织中miR-101a的表达,并分析miR-101a与疾病严重程度的关系。使用重组人TGF-β1处理人肝星状细胞系LX-2,并对LX-2细胞转染阴性对照 miRNA模拟物（NC-mimic组）、miR-101a模拟物（miR-101a-mimic组）、阴性对照 miRNA抑制剂（NC-inhibitor组）或miR-101a抑制剂（miR-101a-inhibitor组）,未转染的细胞作为对照组,然后通过RT-PCR或蛋白质印迹检测激活HSC及ECM产生的关键基因（α-SMA、COL1A1、COL1A2和COL3A1）和蛋白（a-SMA、collagen I和collagen III）的表达水平。将SD大鼠随机分为4组：对照组、CCl4组、Ad-control组和Ad-miR-101a组,对大鼠腹腔注射CCl₄（1 mL/kg体重）诱导肝纤维化模型,每周3次,共4周。然后将5×10⁹感染单位的携带miR-101a的重组腺病毒（Ad-miR-101a）或对照腺病毒（Ad-control）经尾静脉注射到大鼠中。4周后,通过苏木精和伊红（H＆E）和Masson三色染色评估肝脏形态和纤维化,通过免疫组化染色评估肝脏α-SMA、E-cadherin、vimentin、Smad4或p-Smad2/3的表达。结果：与健康受试者相比,HBV相关肝纤维化患者肝组织中miR-101a的表达水平明显降低,并且miR-101a的表达水平随着患者的严重程度升高而降低（P<0.05）。与未处理的细胞相比,miR-101a在TGF-β1处理的LX-2细胞中以浓度和时间依赖性方式显著下降（P<0.05）。与未处理的细胞相比,5 ng/mL TGF-β1处理LX-2细胞中的α-SMA、COL1A1、COL1A2和COL3A1 mRNA表达水平及a-SMA、collagen I和collagen III 蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。与对照组相比,miR-101a-mimic组的α-SMA、COL1A1、COL1A2、COL3A1和TGF-β1 mRNA和a-SMA、collagen I、collagen III、TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达均下调（P<0.05）。与对照组相比,Ad-miR-101a组大鼠肝组织中E-cadherin的表达上调,但α-SMA、vimentin、Smad4和p-Smad2/3的表达下调（P<0.05）;Ad-miR-101a组大鼠的肝组织形态基本恢复正常,肝组织纤维化程度低于CCl₄组。结论：miR-101a水平与乙型肝炎病毒相关性肝纤维化严重程度相关,上调miR-101a可能通过抑制HSC的活化及上皮间质转化发挥抗纤维化作用。     

Smurf1对增生性瘢痕纤维化形成的影响及分子机制

摘要 目的：探究Smurf1对增生性瘢痕形成中纤维化进程的影响及分子机制。方法：收集2021年6月至2022年6月空军军医大学第二附属医院烧伤整形科行增生性瘢痕切除手术患者的瘢痕组织及正常皮肤标本各12例,采用HE和Masson染色进行病理学检查。取增生性瘢痕组织无菌处理后,采取组织块法分离培养获取人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）。将HSF细胞按照实验方案分组,（1）Smurf1过表达分组：对照1组（Con-1组）,空载体组（Vector组）和Smurf1过表达组（OE-Smurf1组）;（2）Smurf1干扰表达分组：对照2组（Con-2组）,阴性组（si-NC组）,Smurf1干扰表达组（si-Smurf1组）。再分别将pcDNA3.1空质粒、pcDNA3.1+Smurf1质粒、si-NC和si-Smurf1转染至Vector组、OE-Smurf1组、si-NC组和si-Smurf1组HSF细胞。通过qRT-PCR检测Smurf1表达水平,Western blot检测蛋白表达水平,CCK-8检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Transwell实验检测细胞侵袭水平,细胞划痕实验检测细胞迁移水平。结果：HE染色和Masson染色结果显示,与正常皮肤组织相比,增生性瘢痕组织的真皮层厚度显著增加,真皮层中存在大量被染成蓝色的胶原纤维,排列紊乱且致密。与正常皮肤组织相比,增生性瘢痕组织中TGF-β1、α-SMA、COL1、COL3、TβR-I、p-Smad3和Smad7的蛋白表达水平均升高（P<0.05）,Smurf1表达水平降低（P<0.05）。与Con-1或Vector组比较,OE-Smurf1组HSF细胞中TGF-β1、α-SMA、COL1、COL3、TβR-I、p-Smad3和Smad7蛋白的表达水平均降低（P<0.05）,HSF细胞增殖、侵袭和迁移水平降低（P<0.05）,凋亡水平升高（P<0.05）。与Con-2组或si-NC组比较,si-Smurf1组HSF细胞中TGF-β1、α-SMA、COL1、COL3、TβR-I、p-Smad3和Smad7蛋白的表达水平均升高（P<0.05）,HSF细胞增殖、侵袭和迁移水平升高（P<0.05）,凋亡水平降低（P<0.05）。结论：Smurf1可能通过抑制TGF-β1/Smad通路,进而抑制增生性瘢痕的纤维化进程。     

藏红花酸对TGF-β1刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响

目的:研究藏红花酸(crocetin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响。方法:体外培养LX-2细胞,随机设立空白对照组,模型组,藏红花酸低剂量组,藏红花酸中剂量组,藏红花酸高剂量组,用含10%血清的1640培养液培养48 h,MTT法测各组细胞增殖,蛋白免疫印迹测定各组细胞α-SMA蛋白的表达,实时荧光定量PCR法测各组细胞Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达。结果:与对照组比较,TGF-β1刺激后人肝星状细胞LX-2增殖作用明显,且上调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,下调Smad7mRNA表达(P0.01)与模型组比较,藏红花酸组均能抑制LX-2细胞增殖,并呈剂量依赖性,高、中剂量组作用明显,能够明显下调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,上调Smad7mRNA表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:藏红花酸对TGF-β1刺激的LX-2细胞中Smad7mRNA具有上调作用,对Smad2、Smad3mRNA具有下调作用,其抗肝纤维化作用可能与抑制TGF-β1/Smads信号转导通路有关。     

糖尿病大鼠血糖控制前后肾小管上皮细胞VEGF、TGF-β1及Smad蛋白表达的动态研究

目的动态观察链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠血糖控制前后肾小管上皮细胞（TEC）中血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、Smad4的表达情况,探讨四者在糖尿病大鼠TEC表型转变和肾间质纤维化中可能发挥的作用及相互关系。方法实验动物随机分为5组,依病程长短分为①A组（2周组）,②B组（4周组）,③C组（8周组）,④D组（16周组）,⑤E组（24周组）,每组分别设有正常对照组（N组）和糖尿病组（a组）;另外,16周、24周两组加设胰岛素治疗组（b组）。采用尾静脉注射STZ法复制糖尿病大鼠模型;免疫组织化学方法检测肾小管VEGF、TGF-β1、Smad2/3、Smad4及α-平滑肌肌动蛋白（-αSMA）和纤连蛋白（FN）的表达;Western blot检测肾皮质VEGF和TGF-β1蛋白;PAS染色光镜观察肾小管基底膜变化及细胞外基质沉积情况等形态学改变;生化方法测定血糖、血肌酐及24小时尿蛋白量。结果正常对照组VEGF、TGF-β1及Smad2/3、Smad4在肾小管均有少量表达,-αSMA在肾小管无表达;糖尿病组肾小管前述四者的表达均显著高于正常对照组,且从16周开始肾小管上皮细胞可见α-SMA蛋白阳性表达;糖尿病16周时肾小管VEGF、TGF-β1、Smad2/3、Smad4两两之间呈正相关;随糖尿病进展,α-SMA及FN在肾小管表达增多,24h尿蛋白增多,肾脏肥大指数增大,而VEGF、TGF-β1二者都分别和-αSMA、FN、24h尿蛋白及肾脏肥大指数呈正相关性;胰岛素治疗后,VEGF、TGF-β1、Smad2/3、Smad4及FN的表达都比糖尿病组明显下降,且各指标之间的正相关性依然存在,-αSMA蛋白则呈阴性表达。结论糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞表达的VEGF、TGF-β1及Smad2/3、Smad4参与了TEC表型转变和肾间质纤维化的发生,并且VEGF和TGF-β1相互作用,共同促进了肾脏损害。胰岛素对DN大鼠TEMT和肾间质纤维化的影响可能部分是通过间接阻断VEGF、TGF-β1和Smad2/3、Smad4在TEC中的合成来实现的。     

AcSDKP对TGF-β1诱导大鼠MSCs向肌成纤维细胞分化的抑制作用

目的:研究N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartly-lysyl-proline,Ac SDKP)对转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向肌成纤维细胞(myofibroblast,MF)分化的影响,探讨Ac SDKP抗纤维化作用的可能机制。方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓MSCs。使用免疫组化,Western blotting技术分析α-SMA蛋白的表达以及Smad2/3,ERK1/2蛋白磷酸化的变化情况。结果:和对照组相比,TGF-β1诱导的MSC中α-SMA、磷酸化-Smad2/3及磷酸化-ERK1/2的表达大大增强,使用Ac SDKP干预细胞则三者的表达量明显下降且呈一定的剂量依赖性。结论:Ac SDKP可以显著抑制TGF-β1诱导的大鼠MSCs向MF分化,可能通过抑制TGF-β/Smad/ERK1/2信号通路的激活,从而发挥其抗器官纤维化作用。     

转化生长因子β1对大鼠心肌细胞肥大的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）及其下游Smad3信号蛋白在大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法：TGF-β1干预培养新生大鼠心肌细胞,流式细胞仪检测心肌细胞总蛋白含量。结扎大鼠腹主动脉复制心肌肥厚模型,在不同时间点处死动物,检测左室质量指数（LVM1）,RT—PCR检测TGF-β1及Smad3的mRNA表达,Westernblot检测Smad3蛋白的表达。结果：不同剂量TGF-β1均能明显增加体外培养的心肌细胞总蛋白含量,TGF-β1（3ng／ml）还增加心肌细胞Smad3 mRNA和蛋白的表达,其表达量1h达高峰,持续至TGF-β1刺激后8h。大鼠腹主动脉结扎术后3d LVMI开始上升并持续至术后28d,心肌组织中TGF-β1、Smad3的mRNA表达水平以及Smad3蛋白表达术后3d也开始上升持续至术后28d,术后14d为表达高峰（P〈0．01）。结论：TGF-β1能诱导大鼠心肌细胞肥大,其信号蛋白Smad3参与了大鼠心肌肥大的病理过程。     

小蘖碱对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌梗死的保护作用

摘要 目的：揭示小蘖碱（BER）对异丙肾上腺素（ISO）诱导大鼠心肌梗死的保护作用及机制。方法：将100只SD大鼠随机分为5组（n=20）：对照组、ISO组、ISO+10BER（BER 10 mg/kg/d）、ISO+20BER（BER 20 mg/kg/d）和ISO+50BER（BER 50 mg/kg/d）。给药组大鼠按照指定的剂量灌胃BER,对照组和ISO组灌胃等体积无菌水,共灌胃2周。然后,除对照组之外,其他组大鼠皮下注射ISO（5 mg/kg/d）,对照组皮下注射等体积的0.9%无菌盐水,连续3 d。通过超声心动图检查大鼠的EF、FS、LVEDD和LVESD;苏木精和伊红（HE）染色评价心肌组织形态学;Masson三色染色用于评估心脏的间质纤维化;2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法检测心肌梗死体积。Western blot检测心肌组织中collagen I、collagen Ⅲ、TGF-β1、TNF-α、Smad3、p-Smad3、NF-κB、α-SMA、Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax和caspase-3的表达。免疫组化评估间隙连接蛋白43(Cx43)的表达。使用试剂盒检测血清SOD、CAT和MDA表达水平。结果：与ISO组相比,BER预处理组大鼠的心肌梗死体积和LVEDD和LVESD显著降低,而EF和FS显著升高（P<0.05）。BER预处理组大鼠的纤维化标志物（collagen I、collagen Ⅲ和α-SMA）表达水平与ISO组相比显著下调（P<0.05）。与ISO组相比,BER预处理组大鼠的TGF-β1/Smad3信号通路和炎症因子（TNF-α和NF-κB）被抑制。BER预处理组大鼠的Cx43阳性染色评分显著高于ISO组（P<0.05）。与ISO组相比,BER预处理组大鼠的促凋亡蛋白（Bax和caspase-3）被下调,而抗凋亡蛋白Bcl-2被上调（P<0.05）。与ISO组相比,BER预处理组大鼠的MDA水平显著降低,而SOD和CAT显著升高（P<0.05）。BER预处理组大鼠的Nrf2和HO-1水平显著高于ISO组（P<0.05）。结论：在异丙肾上腺素诱导的心肌梗死大鼠模型中,小檗碱预处理可通过抑制心脏纤维化、炎症反应、心肌细胞凋亡和氧化应激损伤来减少心肌梗死体积并改善心脏功能。     

栀子苷通过TGF-β1/Smad信号通路抑制肝纤维化和肝星状细胞活化

本研究旨在观察栀子苷对肝纤维化和肝星状细胞活化的影响,并探讨其可能机制。人肝星状细胞LX-2用5 ng/mL转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)处理,并用不同浓度(0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100μmol/L)的栀子苷联合培养,MTT法进行细胞活力测定,LX-2分别经5 ng/mL TGF-β1、TGF-β1+栀子苷(20μmol/L)处理后,用qPCR和Western blot分别检测I型胶原蛋白(collagen I)、纤连蛋白(fibronectin)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、p-Smad2和p-Smad3基因和蛋白的表达。BALB/c小鼠用CCl₄ (25%, 1 mL/kg)诱导肝纤维化,设立对照组、CCl₄组和CCl₄+栀子苷组(40 mg/kg),4周后检测肝功能及血清肝纤维化指标,用HE和Masson染色进行组织学观察,免疫组织化学分析组织α-SMA...     

TGF-β/Smad与Wnt/β-catenin在博莱霉素致大鼠肺纤维化中的表达及相互作用

目的 观察TGF-β/Smad 和Wnt/β-catenin 通路相关基因在肺纤维化大鼠模型肺组织中的表达,探讨两条通路对肺纤维化的影响及其相互作用.方法 取Wistar 大鼠36 只,随机分为正常对照组和肺纤维化模型组,每组18 只.采用气管内注入博来霉素（BLM）建立Wistar 大鼠肺纤维化模型,每组分别于第14、21 和28 天处死大鼠各6 只;取肺组织称重,测定肺组织中HYP、IL-1β水平,观察肺组织Col-I、IL-1β、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA 的表达,并进行HE 染色和Masson 胶原染色.结果 （1）与正常对照组比,造模后14～28 d 大鼠肺指数均明显升高（P ＜0.01）;肺组织HE 染色呈现明显的肺纤维化病理改变,Masson 染色结果可见造模后14 ～28 d 肺间质蓝色胶原呈渐进性增加.（2）造模后第14 天,肺组织IL-1β含量、IL-1βmRNA 相对含量均显著升高（P ＜0.01）,随后逐渐降低,至造模后第28 天IL-1β表达量接近正常水平（P ＞0.05）.（3）造模后14 ～28d大鼠肺组织HYP 含量、Col-I mRNA 相对表达量均明显升高（P ＜0.01）.（4）与正常组相比,模型组中TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-Catenin、LEF-1 mRNA 表达显著增加（P ＜0.01）,且TGFβ1、Smad3 mRNA 分别与Wnt1、LEF-1、β-catenin mRNA 的表达呈显著正相关.结论 TGF-β/Smad 和Wnt/β-catenin 通路相关基因在博来霉素致大鼠肺纤维化中表达上调,两条通路对肺纤维化可能有促进作用且它们间可能存在一定联系.     

多配体蛋白多糖-1在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺上皮间质转化中的作用及机制*

目的:探讨多配体蛋白多糖-1(syndecan-1)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺上皮间质转化(EMT)中的作用及机制。方法:选择清洁级SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组(暴露气管后注射生理盐水,n=10),COPD组(注射1 mg/ml脂多糖后进行烟熏,造模完成后转染100 μl空载病毒,n=10),syndecan-1过表达组(注射1 mg/ml脂多糖后进行烟熏。造模完成后转染100 μl携带大鼠syndecan-1基因的重组腺病毒载体Ad-CMV-GFP-SDC1,n=10),每天1次,连续处理2周。处理结束后检测各组大鼠肺功能并取肺组织;采用HE染色法观察肺组织损伤情况;采用免疫组化检测各组大鼠肺组织syndecan-1、波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)的蛋白表达;采用Western blot检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达水平;采用qRT-PCR法检测各组大鼠肺组织中vimentin、E-cadherin、TGF-β1和Smad2/3 mRNA表达水平。结果:与假手术组相比,COPD组大鼠气道黏膜脱落,管腔狭窄,气道壁较多炎性细胞浸润,肺气肿严重,每分钟呼气量(V_E)、最大呼气流量(PEF)和0.3s用力呼气容积(FEV_0.3)和肺组织E-cadherin mRNA表达水平均显著降低(P＜0.05),而vimentin、TGF-β1、Smad2/3 mRNA表达水平及TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)。与COPD组相比,syndecan-1过表达组气道黏膜脱落及气道壁炎性细胞浸润数减少,管腔狭窄、肺气肿情况均有所改善,V_E、PEF、FEV_0.3和肺组织E-cadherin mRNA表达水平显著升高(P＜0.05),而vimentin、TGF-β1、Smad2/3 mRNA表达水平及TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。结论:COPD大鼠体内TGF-β/Smad信号通路活化且存在肺EMT;过表达syndecan-1可抑制TGF-β/Smad信号通路,减轻EMT,改善COPD大鼠肺组织损伤。     

TGF-β1/Smads通路在哮喘气道重塑中的表达及意义

为了探讨TGF-β1/Smads通路在哮喘气道重塑中的表达及意义,本研究选取清洁级雄性SD大鼠40只,将大鼠随机分为4组,正常对照组,哮喘2周组,哮喘4周组和哮喘8周组,每组10只。其中哮喘2周组、哮喘4周组和哮喘8组大鼠制作哮喘模型,分别在激发哮喘2周、4周和8周后处死,采用HE染色观察各组气道重塑,同时测量气道形态学参数,采用免疫组化染色检测TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白表达。结果表明与哮喘2周组和哮喘4周组相比,哮喘8周组气道支气管壁周围有大量细胞浸润,气道平滑肌增厚,管腔狭窄;哮喘各组总管壁面积、内壁面积和平滑肌面积均明显高于正常对照组(p<0.05),其中哮喘8周组总管壁面积、内壁面积和平滑肌面积分别为(42.26±1.61)μm^2、(34.40±1.22)μm^2和(8.22±1.12)μm2,明显高于哮喘2周组和哮喘4周组(p<0.05);哮喘8周组TGF-β1和Smad2蛋白表达分别为1.562±0.122和1.613±0.121,明显高于哮喘2周组和哮喘4周组(p<0.05),而Smad7蛋白表达为0.251±0.081,明显低于哮喘2周组和哮喘4周组(p<0.05)。本研究初步推测TGF-β1/Smads通路在哮喘气道重塑中有重要作用,其中TGF-β1和Smads可能有促进气道重塑的作用,而Smad7可能有抑制气道重塑作用,值得进一步研究。     

鸢尾素对心肌梗死后大鼠心房颤动和心房间质纤维化的影响

摘要 目的：探讨鸢尾素对心肌梗死后大鼠心房颤动和心房间质纤维化的影响。方法：通过结扎左前降支冠状动脉（LADCA）建立急性心肌梗死（MI）大鼠模型,大鼠每天腹腔注射100 μg/kg的鸢尾素1次,共治疗4周。通过超声心动图检查左室舒张末期直径（LVEDD）、左室收缩末期直径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）、左室缩短分数（LVFS）。应用苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色评估大鼠心肌形态和纤维化情况。蛋白质印迹分析检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、MMP9、TIMP-1、collagenⅠ、collagenⅢ、NLRP3、Caspase 1和IL-1β的表达。结果：与模型组相比,鸢尾素组大鼠的LVEF和LVFS升高,而LVEDD和LVESD降低（P<0.05）;房颤诱发率和房颤持续时间显著降低（P<0.05）;心肌形态明显改善,纤维化面积显著降低（P<0.05）;TGFβ1、p-Smad2/3、collagenⅠ、collagenⅢ和MMP9的蛋白表达水平显著降低,TIMP1的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;NLRP3炎性体、cleaved-caspase-1和IL-1β的表达水平显著降低（P<0.05）。结论：鸢尾素可显著改善心肌梗死动物模型的心脏功能,抑制心肌纤维化和房颤形成,具有较高的临床应用前景。