白介素-1β对高糖刺激的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨炎症细胞因子白介素-1β（interleukin-1βIL-1β）对高糖刺激的人肾小管上皮细胞转分化的影响。-方法体外培养人肾近曲小管上皮细胞株（HKCs）,随机分为正常对照组（5.5 mmol/L normal glucose）;高糖组（30 mmol/L high glucose）;高糖＋IL-1β（5ng/ml）组。分别于处理后24h、48h、72h收集细胞,采用免疫细胞化学染色和Western蛋白印迹法检测细胞角蛋白-18（cytokeratin-18 CK-18）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actinα-SMA）水平。结果高糖能够诱导肾小管上皮细胞α-SMA蛋白的合成增加,而肾小管上皮细胞的标志物CK-18的表达逐渐减少;IL-1β与高糖同时刺激可使肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达进一步增多,而其自身标志物CK-18的表达则明显下降。结论炎症因子IL-1β能增强高糖对肾小管上皮细胞转分化的作用。     

内质网应激特有Caspase-12凋亡途径在高糖刺激的条件永生型小鼠足细胞中的作用

目的检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)标志蛋白GRP78在高糖刺激的条件永生型小鼠足细胞中的表达及其特有Caspase-12凋亡途径与该细胞凋亡之间的关系,探讨高糖是否通过ERS特有Caspase-12凋亡途径诱导了小鼠足细胞凋亡。方法体外培养的小鼠足细胞(mouse podocyte,PC),分为正常糖对照组(NG,1g/l D-glucose)、甘露醇对照组(M,1g/L D-glucose plus 24.4mmol/l mannitol)、高糖组(HG,4.5g/l D-glucose)。分别经细胞同步化、分组干预及刺激12、24、48、72h后收集细胞,应用TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡;免疫细胞化学、Western blot检测GRP78、Caspase-12蛋白的动态表达。结果与正常糖对照组及甘露醇对照组相比,高糖组小鼠足细胞于48h及72h凋亡率明显增高(all P0.01);ERS标志蛋白GRP78从12h表达开始增高,提示永生型小鼠足细胞在高糖刺激下激活了ERS,ERS特有凋亡途径caspase-12随时间的延长表达逐渐增高;相关性分析显示Caspase-12蛋白表达与足细胞凋亡率呈正相关(r=0.915,P0.01)。结论高糖刺激可以引起足细胞凋亡,ERS在高糖对足细胞的损害过程中被诱导,其特有Caspase-12凋亡途径参与了足细胞的凋亡,可能在糖尿病(diabetes mellitus,DM)肾组织损害病理过程中发挥重要作用。     

食管鳞状细胞癌中DICKKOPF-3基因的甲基化状态及表达

目的检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)中Wnt通路拮抗基因DICKKOPF-3(DKK3)的甲基化状态,探讨其与ESCC发生的关系。方法应用甲基化特异性PCR(methylation specificPCR,MSP)及RT-PCR的方法检测78例ESCC及相应癌旁非肿瘤组织中DKK3基因的甲基化状态及mRNA表达情况,应用免疫组化的方法检测通路中心因子-βcatenin蛋白及下游靶基因cyclinD1的表达,并分析其与食管癌发生的关系。结果在ESCC组织中,DKK3基因的甲基化频率为37.2%(29/78),明显高于癌旁非肿瘤组织(χ2=35.622,P=0.000);癌组织中该基因的甲基化率与肿瘤患者临床分期相关(χ2=4.705,P=0.030),而与组织学分级无关;食管癌中DKK3基因mRNA的阳性表达率为65.4%(51/78),明显低于癌旁非肿瘤组织(χ2=13.298,P=0.000)。在发生甲基化的食管癌组织中该基因的mRNA表达缺失及-βcatenin蛋白的异质表达率均明显高于未发生甲基化的癌组织,且差异有统计学意义(χ2mRNA=29.141,P=0.000;χ2-βcatenin=6.245,P=0.012)。食管癌中cyclinD1的表达明显高于癌旁组织,且癌组织中该蛋白的表达与DKK3基因的甲基化状态相关(χ2=4.921,P=0.027)。结论 ESCC组织中DKK3基因高甲基化导致的转录沉默可能与食管癌的发生有关,并可能通过活化Wnt/-βcatenin信号转导通路促进下游靶基因cyclinD1的过表达发挥作用。     

Smad2/3上调促进大鼠梗阻性肾病的纤维化和凋亡

目的观察TGF-β1/Smads信号传导途径对大鼠肾间质纤维化表达的影响.方法 40只Wistar大鼠分为假手术组及模型组.单侧输尿管结扎术式(UUO)建立肾梗阻模型.分别于术后3、6、14和28d处死动物.应用免疫组织化学和流式细胞学技术来检测TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和观察细胞外基质以及细胞凋亡的改变.MASSON染色观察肾间质病变程度.结果与假手术组相比,模型组于术后3d梗阻肾TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3开始升高,细胞凋亡百分率同时升高,I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平亦升高.第6d各项指标水平显著升高.第14、28d升高更加明显(P＜0.01).B3、B6、B14和B28组之间也随天数增加而显著升高(P＜0.01).肾间质病变面积增加显著(P＜0.01).结论在肾间质纤维化中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3及细胞凋亡明显上升,同时I型胶原及α-SMA表达升高及肾间质纤维化程度增加.TGF-β1/Smads信号传导途径在肾间质纤维化形成中可能起着重要促细胞外基质沉积和细胞凋亡的作用.     

高糖和LY294002干预影响足细胞内Ⅳ型胶原表达

探讨高糖和PI3K/Akt通路对足细胞内Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)表达的影响。体外培养小鼠足细胞,给予高糖(30mmol/L)处理后,分别于0,12,24,48h收集细胞,采用免疫细胞化学染色法和Western blot技术检测Col Ⅳ的表达;Western blot技术检测Akt的活化及LY294002对Col Ⅳ表达的抑制效应。结果表明,高糖诱导足细胞内Col Ⅳ蛋白表达增多,24h明显,各时间点与高糖刺激前相比均有统计学差异(P<0.05);高糖激活Akt蛋白磷酸化,p-Akt随刺激时间延长表达增多。PI3K/Akt通路抑制剂LY294002孵育细胞24h后,可减弱高糖诱导的足细胞内Col Ⅳ的表达(P<0.05)。因此,高糖可能通过激活PI3K/Akt通路上调足细胞内Ⅳ型胶原表达。     

静脉注射核因子NF-E2相关因子表达质粒减轻糖尿病小鼠肾小球氧化应激损伤的实验研究

该实验旨在研究经小鼠尾静脉快速注射核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)表达质粒对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠肾小球氧化应激损伤的保护作用。采用腹腔注射STZ诱发糖尿病小鼠模型,自成模后第3天开始,尾静脉快速注射pcDNA3/mNrf2质粒。4周后收取标本,检测动物肾小球丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,纤维连接蛋白(fibronectin,FN)以及Nrf2、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthethase,γ-GCS)在肾小球的表达。实验结果表明,尾静脉注射可以将Nrf2表达质粒转染入小鼠肾小球。此方法可以降低糖尿病小鼠肾小球MDA浓度,减轻FN在肾小球的表达,增加Nrf2在肾小球细胞核的积聚以及γ-GCS的转录和表达。该研究证明,应用尾静脉注射Nrf2表达质粒的方法可以减轻糖尿病小鼠肾小球氧化应激损伤,减少细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,其机制部分是通过激活Nrf2-ARE信号通路而实现的。     

转录因子GADDl53/CHOP的激活与糖尿病大鼠肾组织固有细胞凋亡的关系初探

目的检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)标志蛋白:葡萄糖调节蛋白(GRP78/Bip)、转录因子GADDl53/CHOP在糖尿病大鼠肾脏细胞中表达及其与肾脏固有细胞凋亡之间的关系,初步探讨ERS在糖尿病肾损害中的作用及机制。方法单侧肾切除大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病,于8周应用免疫组织化学检测GRP78、GADDl53/CHOP的表达与定位,TUNEL染色检测细胞凋亡部位,流式细胞术检测细胞凋亡程度,并对GRP78、GAD-Dl53/CHOP表达水平进行半定量分析,同时观察尿蛋白、BUN、尿肌酐等反应肾功能的相关指标。结果建模8周,糖尿病大鼠较正常组的肾细胞凋亡率明显升高,GRP78、GADDl53/CHOP表达明显增加。结论糖尿病肾损害过程中,ERS被诱导并可能通过激活转录因子GADDl53/CHOP引起肾脏细胞过多丢失,在糖尿病肾病的发病机制中起重要作用。