人类新型Krueppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征。采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱。结果获得了Fld4585克隆编码的hBKLFcDNA全长序列,它含1810bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员。HBKLF基因跨越33kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2-p16.1。GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布。HBKLF含有两个转录本,大小为4.4kb-7.5kb和1.35kb-2.4kb。大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF。HBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高。以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用。     

一个可能与T细胞发育相关的新的C2H2型锌指蛋白基因的克隆(英)

一些在组织和细胞分化中起重要作用的蛋白质包含锌指结构域.为了克隆分离和研究与造血细胞分化和发育成熟相关的蛋白基因,利用编码C2H2型锌指蛋白结构域中部分保守氨基酸序列设计简并引物,以骨髓cDNA为模板,进行PCR扩增,得到若干新的锌指蛋白基因EST.用其中一条为探针筛选人骨髓cDNA文库,获得了一个新的锌指蛋白基因全长cDNA,GenBank收录号为AF246126,长3 888 bp,包括一个完整阅读框,编码686个氨基酸,包括17个典型的和2个非典型的C2H2模体,命名为HZF2. RNA印迹、人多组织mRNA斑点杂交分析结果显示, 其在T淋巴细胞发育和定居的器官组织胸腺、淋巴结中有较高表达,在脾脏、胎肝有中度表达,在B淋巴细胞发育的骨髓中表达很低,在外周血几个淋巴细胞系中仅有极微量的表达,提示HZF2可能对于T淋巴细胞发育和增殖有重要功能.该基因也在脑组织的若干部位、胎盘及肾上腺有较高表达,在多种其他组织细胞有微量表达,说明其可能对维持这些组织细胞的生理功能也起一定作用.将编码HZF2读框的DNA顺序克隆到pEGFP-N1载体中,转染3T3细胞,证明表达的HZF2-GFP融合蛋白定位于细胞核,这与根据HZF2蛋白结构推测其可能作为DNA结合蛋白行使调节基因转录的功能是一致的.     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

编码新型转录因子样蛋白的小鼠及人类同源cDNA的克隆(英文)

 通过检索GenBank的表达序列标签 (EST)数据库并结合cDNA末端快速扩增法 (RACE) ,从小鼠胸腺克隆到一个新的cDNA序列 ,并从人类肝癌组织中克隆出了其同源cDNA .根据读码框架分析 ,这两个cDNA分别编码 541和 555个氨基酸的蛋白质 两个蛋白质之间氨基酸序列一致率为77% ,和已知蛋白无显著同源性 .分子生物学软件和网上分析表明 ,两个蛋白质所含功能序列与STAT家族成员极为相似 ,均含有包括酪氨酸蛋白激酶在内的多种蛋白激酶的磷酸化位点和核定位信号 (NLS) ,可能是一种新型转录因子 .RT PCR分析显示 ,两个基因在正常组织中选择性表达 ,其分布相似 ,而且都具有一定程度的与分化或增殖相关的趋势 .     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

人类新型Krüppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征.采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern 杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱.结果获得了FLD4585克隆编码的hBKLF cDNA全长序列,它含1810 bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员.hBKLF基因跨越33 kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2～p16.1.GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布.hBKLF含有两个转录本,大小为4.4 kb～7.5 kb和1.35 kb～2.4 kb.大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF.hBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高.以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用.     

银鲫两个蛋白合成相关基因全长cDNA的克隆及其特征分析

通过构建雌核发育银鲫心跳期SMART cDNA质粒库并从库中随机挑选克隆测序,克隆得到银鲫翻译起始因子3亚单位2(GTIF3—S2)和翻译延伸因子1亚单位α(GEF-1α)基因全长cDNA。银鲫翻译起始因子3亚单位2基因cDNA全长1280bp,开放阅读框位于117—1091bp之间,编码325个氨基酸。其推断的氨基酸序列存在三个WD结构域。该基因在鱼类中为首次报道。银鲫翻译延伸因子1亚单位alpha基因cDNA全长1784bp,开放阅读框位于82—1467bp之间,编码462个氨基酸。RT-PCR表明,这两个基因在成熟卵母细胞和胚胎发育早期可以检测到少量的转录产物,在胚胎发育期间从原肠期开始转录,并随着发育进程逐渐增强。成鱼组织中除精巢表达较弱外,其他组织都表达较强。同源分析比较表明,TIF3-S2和EF-1α在物种进化过程中具有高度的进化保守性,在物种间的同源性很高。因此,作认为,这两个基因是研究物种间系统发育的优良对象。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .     

珊瑚藻R-藻红蛋白γ亚基基因的克隆

根据珊瑚藻(Corallina afficinalis L.)R-藻红蛋白γ亚基N末端部分氨基酸序列(P83592)设计简并引物,结合RACE方法,扩增获得g亚基的全长cDNA序列.结果表明,序列全长为2 308 bp(AY209894),5'非编码区长1 203bp,3'非编码区长145 bp,编码区长960 bp,编码320个氨基酸组成的前体,包含71个氨基酸构成的信号肽和249个氨基酸组成的成熟蛋白.成熟蛋白序列内部存在重复序列与前人的报道一致.珊瑚藻亚基cDNA序列不同克隆子的测序结果表明,g亚基cDNA序列存在不同的3'末端,说明该基因可能存在多个拷贝或存在转录后加工.此外,扩增获得g亚基DNA序列(AY308999),比较表明编码区内部没有内含子存在.本文是对珊瑚藻R-藻红蛋白g亚基基因序列的首次报道.     

人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达

为了研究牛精浆 (bovineseminalplasma ,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用 ,寻找BSP蛋白相关新基因 .采用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术 ,克隆了一个BSP蛋白相关基因的cDNA序列 .应用辐射杂种细胞系 (RH)技术进行了基因染色体定位 .通过RT PCR检测了该基因在人体各组织中的表达情况 .并将该基因编码的蛋白进行了原核表达 .新基因的cDNA长度为 10 5 2bp ,其开放阅读框架 (ORF)编码了一个含 2 2 3个氨基酸残基的蛋白质 ,氨基酸序列中含有 4个纤连蛋白Ⅱ结构域 ,与BSP蛋白在结构上具有一定的相似性 ,称其为人BSP相关蛋白 (humanBSP relatedproteins ,HBRP) .该基因定位于染色体 19q13,在大肠杆菌中表达为 5 2kD的融合蛋白 .研究结果提示 ,应用RACE方法克隆了一种新的人类与BSP蛋白相关的基因 ,推测其编码蛋白是与BSP蛋白功能相关的结合蛋白 ,通过基因重组技术大量获得表达蛋白 ,对进一步研究新蛋白的生物学功能具有重要的意义 .     

人巨细胞病毒IE基因调节子特异DNA结合蛋白cDNA的克隆和鉴定

本文利用人巨细胞病毒(HCMV)IE基因调节子中特异DNA片段作为探针,自人Hela细胞cDNA表达库中筛选并分离出两个编码能与该探针结合的DNA结合蛋白cDNA克隆(DJ-1和EH-2)。其中EH-2编码的蛋白具有明显的DNA结合序列特异性。比较DJ-1和EH-2克隆在HCMV戚染不容性和可容性畸胎瘤细胞中mRNA表达水平,未见明显差异。DJ-1和EH-2克隆可能涉及IE基因表达调控过程。     

黑曲霉糖化酶高产株糖化酶cDNA的合成、克隆和序列分析

从黑曲霉糖化酶高产株T21分离总Poly(A)⁺RNA,经反转录合成cDNA,建立cDNA库。以糖化酶基因片段为探针从cDNA库进行筛选,阳性率达1．6％。由限制酶酶切图谱确定30％的阳性克隆携带全长的糖化酶cDNA。序列分析结果表明,菌株T21虽经多次诱变获得,但糖化酶基因编码区序列与文献报道的黑曲霉糖化酶基因编码区序列一致。从菌株T2l构建的cDNA库中含糖化酶cDNA插入片段的克隆的高比率充分证明,菌株T21中稳态糖化酶mRNA含量很高,显然这是突变株T21糖化酶高产的重要原因之一。     

一个鼻咽癌相关EST的鉴定及其全长cDNA序列分析

鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一.通过对鼻咽癌染色体高频率杂合性丢失区域3p21的表达序列标签(expressedsequencetag,EST)进行同源性比较分析,运用逆转录聚合酶链式反应的方法,筛选到一个在41.18%(14/34)的鼻咽癌活检组织及20.0%(1/5)的鼻咽癌细胞系中表达下调的ESTBG772301;并用Northern杂交方法,检测了该EST在多种正常成人组织中的表达状况及其所代表基因的转录本大小.在此基础上,对该EST来源的cDNA克隆(IMAGE:4839190)进行直接测序,获得了一个全长为2377bp的新cDNA序列;经生物信息学分析,发现它与已知基因序列无明显同源性,属于一个新基因,定位于染色体3p21.3,被命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRG,GenBank登录号:AF538150).其编码的蛋白质含169个氨基酸,与一个已报道的在进化上相对保守、功能未知的人类蛋白Nicolin1(简称NICN1)N端170个氨基酸残基的序列同源性为97%,但缺少NICN1蛋白C端43个氨基酸残基,可能是nicolin1基因不同剪接本的编码产物.     

羊草OEE1基因的克隆及盐胁迫下的表达

从羊草(Leymus chinensis )叶片cDNA文库中克隆得到可能编码33 kD的光系统Ⅱ(PSⅡ)外周蛋白(oxygen-evolving enhancer protein1,OEE1)全长cDNA(GenBank登录号为EF583851),命名为LcOEE1.序列分析结果表明,该cDNA全长1 107 bp,5′非编码区为32 bp,3′非编码区为71 bp,编码区长987 bp,编码328个氨基酸.BALSTp比对发现,该基因氨基酸序列与已报道的小麦和水稻中的OEE1序列具有95%和94%的相似性.聚类分析表明,该基因与小麦和水稻的亲缘关系较近,与拟南芥和菠菜OEE1基因的亲缘关系较远.Northern杂交结果表明,在200 mmol/L的NaCl处理7 d的幼叶中,OEE1 mRNA的表达量明显高于未处理的对照,说明羊草中OEEl基因受盐诱导.     

小鼠TIM1,TIM2和TIM3基因的克隆与序列分析

目的：克隆小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因全长编码区cDNA,同时对其进行序列分析.方法：采用RT-PCR方法,从小鼠活化淋巴细胞中获取TIM1、TIM2及TIM3基因cDNA全长,克隆至pMD18-T载体,选择阳性克隆进行序列测定.结果：扩增得到小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因编码区cDNA全长分别是918bp、918bp和846bp,分别编码306、306和282个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致.结论：获得小鼠TIM1、TM2及TIM3基因的全长克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏,通过简并引物克隆解偶联蛋白2(un-couplingprotein2,UCP2)cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2cDNA全序列。序列分析结果表明,鲢鱼肝脏UCP2cDNA全长1452bp,其中5′-UTR长337bp,3′-UTR长182bp,编码区933bp,编码310个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现,鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达,而在脑组织表达量较低,这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致,表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

烟草FIE和MSI1基因的克隆及序列分析

采用电子克隆与实验克隆结合的方法获得了烟草胚乳发育相关基因NTFIE和NTMSI1的cDNA序列,序列号分别为EU375458和EU375459.序列分析结果表明,这两个cDNA序列均含有完整的开放读码框,分别编码370和424个氨基酸,含有保守的WD基序.氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间FIE和MSI1基因编码氨基酸序列同源性都较高.组织表达分析结果表明,这两个基因均具有一定程度的组织表达特异性,NTFIE cDNA基因在花中的表达量最多,但在根和茎中未检测到表达,而NTMSI1 cDNA基因只在离体培养的细胞和根中特异性表达.     

小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析

根据已克隆植物抗病(R)基因NBS保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),在小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中进行抗病同源基因cDNA全长的扩增。获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S11A11cDNA序列,该序列全长2923bp,编码878个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域。聚类分析表明,S11A11编码的蛋白与小麦抗叶锈病基因Lr1编码的蛋白亲缘关系较近,而与Lr10亲缘关系较远。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础。     

小鼠Mterf2基因cDNA的克隆、序列分析与组织表达特征

目的:克隆BALB/c小鼠线粒体转录终止因子2(Mterf2)基因cDNA编码区序列,分析Mterf2 mRNA和蛋白质在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、胰腺、肌肉和睾丸等9种组织中的表达情况。方法:以BALB/c小鼠肝组织总RNA为模板,RT-PCR扩增Mterf2基因cDNA编码区序列,将其克隆至pMD-19T载体,通过菌落PCR、双酶切和DNA序列测定进行验证;采用MEGA 6.0软件构建Mterf2基因系统发生树;通过Northern印迹和qRT-PCR方法检测Mterf2基因mRNA在小鼠各组织中的表达量;通过Western印迹检测MTERF2蛋白在小鼠多个组织中的表达量。结果:克隆获得BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,其全长1158 bp,编码385个氨基酸残基,克隆到的序列与GenBank参考序列的同源性为100%,无任何碱基突变和移码突变。小鼠Mterf2基因与大鼠Mterf2基因的同源性最高,达到91.0%,在系统发生树上聚类为一簇。Mterf2基因mRNA和蛋白质在BALB/c小鼠心、脑、肝和肾等新陈代谢旺盛的组织中表达丰度最高,其次是在胰腺、睾丸和肌肉组织,而在脾和肺组织中表达相对较低。结论:克隆了BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,并进行了多种组织的表达特征分析,为后续研究Mterf2基因在实验动物体内的生理功能奠定了基础。     

一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究

为了研究乙肝病毒侵染肝细胞过程中的功能蛋白 ,通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码乙肝表面抗原结合蛋白 (hepatitisBsurfaceantigenbindingprotein ,HBsAg BP)的cDNA克隆 .基因测序结果表明 ,该cDNA具有独立的开放阅读框架 ,编码 1个由 344个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子 ,属于免疫球蛋白超家族成员 .将该基因克隆到原核表达载体pTriplEx后 ,在E .coliXL1 Blue菌株中获得 4 4kD的重组蛋白 .重组蛋白经Western印迹和ELISA实验证明具有与乙肝表面抗原特异性结合的能力 .进一步经流式细胞仪实验显示 ,在纯化的重组蛋白存在的情况下 ,天然的HBsAg与肝细胞株HepG2的亲和力显著增高 .结果显示 ,该乙肝表面抗原结合蛋白可能是介导乙肝病毒对肝细胞亲和侵染的可溶性辅助受体 .