筛选环孢霉素A适体的SELEX技术的建立

体外合成一个全长78个核苷酸,中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,运用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术,以环孢霉素A(CsA)为靶目标,以磁珠作为筛选介质,利用生物素 链酶抗生物素 辣根过氧化物酶系统,检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力,筛选并鉴定CsA特异性的适体.经过11轮的筛选,ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势.将第10轮筛选产物克隆测序并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析.随机挑选的19个克隆适体,根据一级结构的同源性可分为5个家族,二级结构预测以茎环(发夹)为主,这可能是适体与CsA作用的部位. CsA特异性的适体将用于酶联法、免疫荧光法等对CsA进行检测.     

用SELEX技术筛选环孢霉素A适体

目的：运用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选并鉴定环孢霉素A（CsA）特异性适体。方法：合成全长78个核苷酸中间含35个随机序列的随机单链DNA（ssDNA）文库,通过SELEX方法,以CsA为靶标、磁珠为筛选介质,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力,筛选针对CsA的适体,将最后一轮筛选产物克隆测序,并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析。结果：经过10轮筛选,ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势,随机挑选的19个克隆适体根据一级结构的同源性可分为5个家族,二级结构预测以茎环（发夹）为主。结论：通过改良SELEX方法筛选得到了CsA特异性的适体。     

金黄色葡萄球菌外毒素B特异性适体的筛选及其应用

目的:利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,筛选能与金黄色葡萄球菌外毒素B(SEB)特异、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA)适体,并将该适体应用于患者血清标本的检测。方法:从体外合成的96核苷酸随机ss-DNA文库中,以羧基磁珠作为筛选介质,经逐步PCR扩增、筛选,获得针对SEB的高亲和力、高特异性适体;利用荧光素标记适体测定筛选过程中各轮结合力;利用酶连接适体方法检测适体特异性和结合力。结果:经过13轮筛选,ssDNA文库与SEB的结合百分率从1.1%提高到39.8%,增加了36倍;获得的ssDNA适体(A11)针对SEB的特异性强,与金黄色葡萄球菌表面蛋白A(SPA)结合低,并能初步识别患者血清。结论:利用SELEX技术筛选获得了特异结合SEB的高亲和力的ssDNA适体,为金黄色葡萄球菌的临床诊断与治疗奠定了基础。     

靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)粘肽合成酶PBP3的抗菌先导化合物的虚拟筛选及活性研究

【目的】开发出与铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3有高亲和力,具有全新结构的先导化合物。【方法】以铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3为靶点,通过分子对接软件DOCK6.5,对含有104万个小分子化合物的数据库进行了大规模虚拟筛选,选取结构相对简单的中选化合物进行合成,得到先导化合物,并验证其抑菌活性。【结果】通过grid score进行第一轮初筛,筛选出grid score分值小于–30 kcal/mol的6万个化合物,接着以amber score进行第二轮筛选,筛出amber score分值小于–20 kcal/mol的化合物约200个。最终,经过观察分析,从中挑选出4种打分高并且结构新颖的小分子化合物作为先导化合物。合成出的先导化合物及其衍生物对铜绿假单胞菌等常见微生物的最小抑菌浓度(MIC)在175–275μg/m L之间,对革兰氏阴性菌和阳性菌均有效,MIC值比作为阳性对照的磺胺嘧啶更低,说明先导化合物具有较好的抗菌活性。【结论】这些先导化合物可以进一步开发为新型抗菌药物,用于解决铜绿假单胞菌的耐药性问题。     

CP4- EPSPS转基因蛋白的适体筛选与亲和性分析

目的:通过筛选获得CP4 - EPSPS转基因蛋白的最优适体,为应用于检测作准备.方法:体外合成长度为78个碱基的随机ssDNA文库,应用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以CP4 - EPSPS转基因蛋白为靶目标进行15轮筛选,将筛选到的适体群进行克隆、测序,用DNAMAN软件对每个适体的保守序列和二级结构进行分析并应用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统进行亲和性分析.结果:成功获得靶目标的最优适体,即D04号适体,结合率最高(2.2745)为最低的5.9倍.结论:筛选流程合理、可行,实验结果较理想.     

rsmA调控基因的筛选及其相关表型测定

为了筛选对rsm A具有调控功能的相关基因及这些基因对铜绿假单胞菌致病性的影响,通过构建染色体组上整合有rsm A-lux CDABE报道子的铜绿假单胞菌菌株,并以rsm A基因表达为线索进行随机转座突变,利用发光变化筛选出对rsm A基因表达有影响的转座突变体.最终共得到约30000个克隆,经筛选得到20株发光明显变化的突变体,其中rsm A表达增强的有6个克隆,而rsm A表达减弱的有14个克隆.通过随机PCR并对产物测序及比对,最终确定7个被破坏的基因.对致病性相关表型测定,结果表明细菌运动性、绿脓菌素、鼠李糖脂和胞外多糖产量等均受到不同程度的调节.这些基因对rsm A表达有调节作用,并可能通过rsm A影响铜绿假单胞菌的多个致病因子及致病性.     

铜绿假单胞菌荧光实时定量PCR标准品的构建

构建了荧光实时定量PCR标准品以检测水中的铜绿假单胞菌.利用所报道的铜绿假单胞菌gyrA基因为目的基因设计引物,通过培养细胞,煮沸法裂解细胞后做PCR,电泳,胶回收,然后与pMD19-T Vector连接并转化到感受态大肠杆菌中;氨苄青霉素筛选出白色菌落,菌落PCR及测序鉴定其特异性,根据OD值确定浓度,制备梯度浓度参考标准品,制作标准曲线,检测水样品中铜绿假单胞菌的菌量.     

下呼吸道感染耐环丙沙星铜绿假单胞菌的分布与耐药性

目的了解耐环丙沙星铜绿假单胞菌的流行情况,分析耐环丙沙星铜绿假单胞菌的耐药性,比较耐环丙沙星铜绿假单胞菌与环丙沙星敏感铜绿假单胞菌的耐药性差异。方法选择贵阳医学院第三附属医院2011年6月至2014年11月下呼吸道感染标本中分离出的231株耐环丙沙星铜绿假单胞菌与环丙沙星敏感铜绿假单胞菌,按照《全国临床检验操作规程》进行微生物病原菌鉴定。采用Kirby-Bauer琼脂扩散法进行药敏试验,结果使用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果下呼吸道感染标本中共分离出铜绿假单胞菌231株,其中耐环丙沙星铜绿假单胞菌检出率25.54%。从科室分布看,神经外科分离率最高,占47.46%,其次ICU、呼吸内科与消化内科分别占18.64%、13.56%、10.17%;下呼吸道感染耐环丙沙星铜绿假单胞菌菌株与环丙沙星敏感铜绿假单胞菌菌株对头孢曲松、阿米卡星、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等19种抗菌药物的耐药率分别为95.65%,71.83%;42.86%,7.69%;17.39%,2.70%;33.33%,11.02%;22.22%,8.00%。下呼吸道感染耐环丙沙星铜绿假单胞菌菌株耐药率明显高于环丙沙星敏感铜绿假单胞菌菌株,差异具有统计学意义(P0.05)。结论耐环丙沙星铜绿假单胞菌表现为多重耐药性,给临床治疗带来很大的困难。因此严格掌握抗菌药物的选用是延缓病原菌对抗菌药物耐药的有效方法。     

抗菌肽Lfcin15-Me8分子设计及对老年呼吸道致病菌铜绿假单胞菌的抑菌性能分析

探讨人工设计合成的Lfcin15-Me8分子对老年病患者中铜绿假单胞菌抑菌活性研究。从老年病患痰液中分离鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染情况,截取牛乳铁蛋白素(Lfcin B)1-15和蜂毒素(Melittin)1-8核心氨基酸序列,固相合成新型抗菌肽分子,采用微量肉汤稀释法,测定新型抗菌肽分子对临床分离菌株的抑菌活性。结果显示,铜绿假单胞菌占院内感染的32.2%,位列致病菌第二位。合成的新型抗菌肽分子Lfcin15-Me8,为阳离子型抗菌肽,并富含α-螺旋。对临床铜绿假单胞菌抑菌MIC值均达到128μg/m L以下,其中最低达到32μg/m L,具有良好抗菌活性。铜绿假单胞菌在老年呼吸道感染中占较大比重,需注意防控,人工合成的Lfcin15-Me8分子可抑制临床铜绿假单胞菌的生长繁殖。     

铜绿假单胞菌的MALDI-TOF-MS检测方法的建立

目的 建立利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪( MALDI-TOF-MS)对铜绿假单胞菌的快速检测方法.方法 通过MALDI-TOF-MS法对铜绿假单胞菌进行检测分析,并与生化鉴定方法相比较.结果 MALDI-TOF-MS对铜绿假单胞菌的检测后得到肽指纹图片及相关质谱数据,建立MALDI-TOF-MS对铜绿假单胞菌的快速检测方法.结论 MALDI-TOF-MS方法检测铜绿假单胞菌准确快速、操作简单等特点,可发展成为食品检验铜绿假单胞菌的重要(辅助)工具.     

A类Ⅰ型清道夫受体调节小鼠腹腔巨噬细胞抗肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌感染

本研究旨在探讨A类Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor class A type Ⅰ,SR-AI)在呼吸道感染常见病原体肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌感染过程中的免疫调节功能。以肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌临床分离株与野生型小鼠和SR-AI~(-/-)小鼠腹腔原代巨噬细胞互作,研究SR-AI在吞噬和炎症反应中的作用。荧光染料染色菌体及检测胞内荧光强度,数据显示SR-AI敲除后巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力下降,但对铜绿假单胞菌的吞噬能力升高。采用实时定量荧光聚合酶链反应检测相关炎症因子mRNA水平,发现SRAI敲除后肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌刺激巨噬细胞引发的炎症反应均增强。结果表明,SR-AI参与巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬,但不参与对铜绿假单胞菌的吞噬,且可能抑制了肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌引发的炎症反应。     

银染法观察铜绿假单胞菌生物被膜

目的 评估银染法鉴定铜绿假单胞菌生物被膜的效果.方法 体外平板法制备铜绿假单胞菌生物被膜模型,用银染法观察鉴定.结果 银染后普通光学显微镜和扫描电镜观察铜绿假单胞菌生物被膜.结论 银染法鉴定铜绿假单胞菌生物被膜简单可靠.     

铜绿假单胞菌铁摄取调节子Fur诱导表达突变株构建及表型分析

铁摄取调节子 (Ferric uptake regulator,Fur) 是细菌控制细胞内铁平衡的一类重要的调节子。铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的fur为必需基因,不能直接敲除。文中通过构建诱导型缺失突变株Δfur/attB::PBAD-fur,来研究该基因对铜绿假单胞菌的生长、生物被膜形成、运动能力和抗氧应激能力等方面的影响。结果表明,当Fur低表达时,铜绿假单胞菌在高铁和低铁环境中出现了生长阻滞的现象;低表达Fur的铜绿假单胞菌抵抗H2O2的能力降低,形成生物被膜的能力减弱,游动、颤动 (Twitching) 和丛集 (Swarming) 运动能力也出现了减弱的现象。Fur的表达直接影响铜绿假单胞菌荧光嗜铁素的产量。在铜绿假单胞菌体内表达来自格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌Fur超级家族中的蛋白,可以部分恢复铜绿假单胞菌荧光嗜铁素的产量。由此说明,Fur对铜绿假单胞菌的生长、生物被膜形成、抗氧应激能力和运动能力方面都起着至关重要的作用。本研究为铜绿假单胞菌的防治提供理论指导。     

铜绿假单胞菌必需基因的研究进展

铜绿假单胞菌为专性需氧非发酵革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一,可引起呼吸道、泌尿道、烧伤创面和菌血症等严重感染。铜绿假单胞菌耐药形势日益严峻,给临床治疗带来困难。必需基因是生长过程中必不可少的看家基因,对铜绿假单胞菌必需基因进行深入研究,不仅有助于了解细菌的生长、毒力等基本特性,也有助于筛选新的抗菌药物靶标。本文针对铜绿假单胞菌及其必需基因进行综述,首先介绍了铜绿假单胞菌的基本生理特性及目前耐药趋势,又归纳了必需基因的研究方法,最后对铜绿假单胞菌必需基因的研究进展进行总结。     

铜绿假单胞菌多重耐药基因的筛选及鉴定

[目的]研究铜绿假单胞菌中与耐药性相关的基因.[方法]筛选转座突变体文库中对多种抗菌药物敏感的突变体,通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]筛选得到2株对多种抗菌药物敏感的突变体,其中被破坏的基因分别为功能未知的新基因PA2580和PA2800.[结论]PA2580和PA2800可能分别通过参与细胞氧化还原作用和细胞壁合成进而与铜绿假单胞菌耐药性相关.     

基于聚合酶螺旋反应技术快速检测铜绿假单胞菌

【背景】铜绿假单胞菌是一种重要的水源和食源性致病菌,可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。加强铜绿假单胞菌的快速检测,对保障食品安全具有重要的意义。【目的】建立聚合酶螺旋反应(Polymerasespiralreaction,PSR)方法快速检测铜绿假单胞菌。【方法】针对铜绿假单胞菌外毒素A调控基因——ETA基因(toxA)设计引物,通过引入加速引物、优化反应条件和筛选颜色指示剂,建立快速检测铜绿假单胞菌的PSR方法,并研究方法的特异性、敏感性和可靠性。【结果】建立的方法在等温65°C条件下,40 min内可完成PSR反应,且可通过钙黄绿素和羟基萘酚蓝直接判读结果。方法特异性强、灵敏度高,最低检出限分别为20 CFU/mL细菌和1.011 5 pg/μL基因组DNA。可视化PSR方法检测包装饮用水来源的分离菌株与传统生化方法检测结果一致。【结论】研究建立的可视化PSR方法为铜绿假单胞菌DNA快速检测提供了一种可行的有效手段。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属酶的筛选及基因型研究

目的研究重庆医科大学附属第一医院分离的29株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中金属酶（Metallo-β-Lactamase,MBL）的基因型分布情况。方法用亚胺培南-EDTA纸片法筛选29株铜绿假单胞菌中产MBL的铜绿假单胞菌,用PCR扩增法检测29株菌中金属酶VIM和IMP基因。结果29株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中,亚胺培南-EDTA纸片法筛选出MBL阳性菌株5株,阳性率为17％。PCR扩增出IMP基因型有4株,阳性率为14％,均为金属酶IMP-9型,未扩增出VIM基因。以PCR法结果为判定标准,亚胺培南-EDTA纸片法敏感性100％,特异性96％。结论IMP-9型为该院分离的这29株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中主要MBL基因型。本实验中所用的亚胺培南一EDTA纸片法能简单有效的筛选出产MBL的铜绿假单胞菌。     

口腔细菌对铜绿假单胞菌黏附及侵入肺上皮细胞能力的影响

目的 通过比较铜绿假单胞菌和口腔细菌单独或共同作用于肺上皮细胞时,细菌黏附和侵入细胞的能力,探讨细菌间相互作用在呼吸道感染的最初阶段的作用机制.方法 应用培养法和抗生素保护法检测铜绿假单胞菌和口腔细菌单独或共同作用于肺上皮细胞时,细菌黏附和侵入肺上皮细胞的能力.结果 铜绿假单胞菌与口腔细菌共同作用于肺上皮细胞,牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌降低了铜绿假单胞菌的黏附能力,却增强了其侵入能力;而铜绿假单胞菌能够影响口腔细菌对肺上皮细胞的黏附,同时增强口腔细菌侵入肺上皮细胞的能力.结论 口腔细菌,尤其是牙周可疑致病菌主要通过增强铜绿假单胞菌对肺上皮细胞的侵入而影响呼吸道感染过程.     

甲型链球菌与铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌生长及粘附影响的体外观察

目的:观察甲型链球菌与铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌生长及粘附的影响.方法:建立白假丝酵母菌的生长梯度模型,并引入甲型链球菌与铜绿假单胞菌或其培养后上清;建立人脐周静脉内皮细胞EVC-304的六孔板生长模型,与上述白假丝酵母菌生长梯度(引入及未引入甲型链球菌与铜绿假单胞菌)共同孵育.计数粘附数.结果:引入甲型链球菌与铜绿假单胞菌的白假丝酵母菌生长缓慢,对人脐周静脉内皮细胞的粘附数减少;而引入甲型链球菌与铜绿假单胞菌培养后上清的白假丝酵母菌生长良好.结论:甲型链球菌与铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌生长及其对人脐周静脉内皮细胞的粘附有明显的抑制作用,且此种抑制作用与甲型链球菌与铜绿假单胞菌的分泌作用无关.     

植物发酵液提取物对铜绿假单胞菌生物膜的作用

【目的】探讨植物发酵液提取物(plant fermentation extract,PFE)对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用,为临床上铜绿假单胞菌感染相关疾病的治疗提供参考。【方法】通过划线法分离临床标本中的铜绿假单胞菌并进行鉴定,通过报告菌株测定铜绿假单胞菌的毒力因子,采用试管法和激光共聚焦扫描显微镜测定生物膜的形成。【结果】在分离出的16株铜绿假单胞菌中,PFE对PA007菌株的作用效果最好,1%PFE显著降低PA007菌株生物膜、绿脓菌素和N-(3-oxododecanoyl)-HSL(3-oxo-C12-HSL)的产量(P0.05)。同时,也显著降低Las A蛋白酶的活性以及持留菌存活率(P0.05)。荧光定量PCR实验结果表明PFE能显著抑制las I和pqs A基因的表达(P0.05)。【结论】PFE具有抗铜绿假单胞菌感染能力,在临床上铜绿假单胞菌感染疾病的治疗中具有巨大的潜在价值。