铜绿假单胞菌多重耐药基因的筛选及鉴定

[目的]研究铜绿假单胞菌中与耐药性相关的基因.[方法]筛选转座突变体文库中对多种抗菌药物敏感的突变体,通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]筛选得到2株对多种抗菌药物敏感的突变体,其中被破坏的基因分别为功能未知的新基因PA2580和PA2800.[结论]PA2580和PA2800可能分别通过参与细胞氧化还原作用和细胞壁合成进而与铜绿假单胞菌耐药性相关.     

铜绿假单胞菌耐药性相关基因的筛选及鉴定

铜绿假单胞菌在人体内能引起严重的感染. 由于铜绿假单胞菌高水平的内在性和获得性耐药性, 使其引起的感染难以治愈. 为解决该问题, 弄清病原菌抗生素抗性的分子机制是一个关键. 本实验构建了含有17000个铜绿假单胞菌转座突变株文库, 并在LB固体平板上, 用7种抗生素在最小抑制浓度(MIC)和1/2MIC条件下, 筛选抗生素抗性发生变化的突变株. 结果确定了43株转座突变株, 每个突变株对至少一种抗生素的敏感性表现出增加3倍或降低1/2的表型. 通过随机PCR和DNA测序, 确定了这些铜绿假单胞菌突变体中转座子在基因组上的插入位点, 确定了被破坏的基因. 其中, 9个是已知的与抗生素抗性相关基因, 包括mexI, mexB和mexR; 24个是以前未知与抗性相关的基因, 包括一个菌毛合成基因pilY1, 这个菌毛合成基因的破坏导致菌株对羧苄青霉素的MIC增加了128倍. 此外, 43个基因中有12个是功能完全未知的基因. 这些基因的筛选鉴定有助于了解铜绿假单胞菌中抗生素抗性的产生机制, 这些基因或许可成为控制或扭转抗生素抗性的作用靶点.     

PA2580基因与铜绿假单胞菌环境压力耐受性相关

【目的】研究铜绿假单胞菌PAO1 PA2580基因的功能。【方法】构建了PA2580的敲除突变体及突变体互补体,通过最小抑制浓度测定、基因启动子活性检测、蛋白体外表达纯化等方法,对PA2580基因的功能进行了深入的研究。【结果】PA2580突变体对羧苄青霉素、氯霉素、环丙沙星的敏感性增强。PA2580基因的表达还受到不同种类的低于抑制浓度的抗生素的调节。PA2580蛋白产物以NADPH为电子供体,能够高效还原多种醌类物质。此外,PA2580突变体对过氧化氢敏感性增加,过氧化氢酶编码基因在PA2580突变体中的表达降低,表明PA2580与铜绿假单胞菌氧化压力耐受性相关。【结论】PA2580产物是NADPH-醌类的还原酶,其功能与铜绿假单胞菌对环境压力的耐受密切相关。     

谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性的关系

铜绿假单胞菌由于对抗生素的固有耐药和多重抗药性, 已成为医院内感染的重要病原菌之一。谷胱甘肽是细胞内最重要的抗氧化剂, 保护细胞免受氧化压力的损害。但是在铜绿假单胞菌感染的组织中, 由于绿脓菌素等致病因子的存在, 可以导致谷胱甘肽的水平降低。同时, 谷胱甘肽又可以增强绿脓菌素的致病性。本文就谷胱甘肽与铜绿假单胞菌关系的最新研究进展并结合作者的工作, 对上述问题进行了综述和探讨。     

铜绿假单胞菌随机启动子库的构建及受铁调控基因的筛选和鉴定

[目的]针对铁这种几乎所有微生物都必需的,对病原菌尤为重要的营养元素,在全基因组水平上检测铜绿假单胞菌的铁感应基因.[方法]采用含LuxCDABE报道子的质粒pMS402为载体,构建了铜绿假单胞菌的随机启动子库,建立了特定条件下研究铜绿假单胞菌全基因组基因表达变化的高通量平台.[结果]验证了2个已知的受铁调控的基因,并发现了尚未报道的二氢叶酸还原酶,磷酸葡萄糖脱水酶和柠檬酸铁转运蛋白受铁调控的现象,发现与铁相关的四个功能未知的基因和3个假定蛋白的基因.[结论]研究结果对于阐明铁在铜绿假单胞菌中的调控作用,揭示铁对细菌生理及致病性的作用机制提供了理论基础.随机启动子库的构建也为细菌基因组水平研究基因表达提供了一个有用的工具.     

铜绿假单胞菌群体感应抑制物筛选系统的构建及其应用

针对调控铜绿假单胞菌致病基因表达的群体感应系统,将相关基因lasI和rhlA的启动子域与蔗糖致死基因相融合,构建出一个能通过菌体生长量来检测群体感应系统小分子抑制物的筛选体系。并在特定条件下,对一系列中药提取物进行筛选,同时用荧光筛选系统对结果进行验证。以此筛选出3种中药提取物对铜绿假单胞菌群体感应系统有不同程度的抑制作用。这3种中药分别隶属于爵床科、败酱科和萝藦科植物。本研究所构建的筛选体系能有效地筛选群体感应系统的抑制物,为进一步了解和控制细菌的致病感染过程和新药物的研究提供了一个有用的工具。     

细菌降解萘、菲的代谢途径及相关基因的研究进展

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类在环境中广泛存在的具有毒性的污染物,微生物降解是其在自然界中降解的主要途径,因而尤为重要。随着研究的深入,关于微生物降解PAHs的分子降解机制、途径等的认识逐渐积累。以下对细菌降解萘、菲的研究进展进行了概述,介绍了萘的水杨酸降解途径,菲的水杨酸、邻苯二甲酸及其他降解途径,同时也包括降解过程中涉及的降解基因簇,如nah-like、phn、phd、nid和nag等以及细菌在PAHs胁迫条件下其他相关基因的表达与调节等方面的最新进展。这些进展可为降解菌株的分子及遗传机制研究提供理论依据,将促进通过基因工程优化降解菌、更有效地检测PAHs环境污染及实现PAHs污染的生物修复。     

铜绿假单胞菌中群体感应系统研究进展

群体感应系统(Quorum-sensing system,QS)是一个依赖于细胞数量的基因调控系统。系统中的自诱导物(Autoinducer或AI)随细胞的数量增加而变化,当细胞数达到一定数量时,系统中的自诱导物达到一定的域值时可以与一类转录调节蛋白结合,开始诱导或抑制数量众多的基因表达,使细菌表现多细胞特性的群体行为。同时,群体感应系统受到许多外界环境因素的影响,其调节途径是一个极其复杂的级联过程。此外,以群体感应系统为药物靶点来筛选新型抗菌药物越来越受到人们的重视。结合作者本人的工作及铜绿假单胞菌中群体感应系统的最新研究进展,对该系统在铜绿假单胞菌中的作用及其调控途径进行分析、探讨和总结。     

铜绿假单胞菌中一个新的吩嗪合成调节基因

[目的]在次抑制浓度四环素条件下,研究铜绿假单胞菌phzAl操纵子的调节基因及调节途径.[方法]对转座突变库中phaAl操纵子表达发生变化的突变体,进行随机PCR、基因测序及比对,确定突变位点.并以发光杆菌的荧光素酶基因操纵子luxCDABE为报道基因,研究基因调节作用及调节路径.[结果]在两株突变体PAM0487和PAM0487R中phzAl操纵子的表达降低,这两株突变体的突变基因确定为假定钼元素转运蛋白调节子PA0487基因.[结论]PA0487是phzAl操纵子表达的一个新的正向调节子,并对密度感应系统相关基因的表达有凋节作用.     

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选

为了在基因组水平筛选获得铜绿假单胞菌PAO1对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因,本研究通过构建PAO1转座突变体文库、筛选对亚胺培南、美罗培南和比亚培南耐药及敏感突变株;通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对的手段,确定了突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因,获得了48个PAO1中对碳青霉烯类抗生素耐药和敏感相关的基因,其中27个基因突变后表现为耐药性增强,21个基因突变后表现为药物敏感性增强.本实验筛选获得的48个基因中有5个与Alvarez-Ortega和Dotsch等人筛选的基因重复.通过对PA0011,PA0667及PA3901进行基因敲除及遗传互补,进一步确证这3个基因均与PAO1对碳青霉烯类的耐药性相关.本次筛选发现了38个新的与碳青霉烯类耐药相关的基因,其中包括13个class4类基因.对这些新基因的进一步研究,不仅有利于全面了解铜绿假单胞菌的耐药机制及其调控网络,而且有利于药物作用靶点的发现,为有效治疗铜绿假单胞菌的感染提供新思路.