生物素标记DX_(13)探针及一例甲型血友病家系分析

 以Bio-ll-dUTP替代dTTP经二步法缺口平移标记DNA片段制得生物素DX_(13)探针。其碱性磷酸酶ABC体系显色灵敏度为100fg(约5×10~(-18)mol);与5μg染色体DNA进行Southern印迹杂交,可得清晰的单拷贝杂交区带。以此探针对一血友病家系做RFLP分析,确定两成员为甲型血友病基因携带者。与32P探针对比,两种探针的杂交和分析结果完全一致。表明高标记的生物素探针可应用于单拷贝基因分析和基因诊断。     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

生物素代替放射性同位素标记探针——基因探测技术的新改进

迄今为止,分子生物学家研究人类DNA单拷贝基因组织的最灵敏方法是利用~(32)P-脱氧核苷三磷酸(~(32)P-dNTP)标记的分子探针,与转移到硝酸纤维素膜上的 DNA 杂交后观察放射自显影条带,进行限制性内切酶图谱分折。~(32)P-dNTP半衰期短,价格昂贵,使用不太方便;~(32)P-还含有一定的硬β射线,对实验者身体有害。最近美国耶鲁大学医学院Leary等用生物素标记探针,并借用免疫学方法,创建了一种快速、灵敏的酶标反应显色技术,(见Leary J.J.et al:Proc.Nat.Acad.Sci.USA,80:4045,1983)有可能打破同位素在     

一例智力低下患者7q~ 标记染色体的来源鉴定

以人类染色体显微切割、PCR技术构建的现有人类染色体特异性和染色体区带特异性探针池作为绘画探针,采用正向染色体绘画技术,结合染色体筛查方法,查明了一例7q~ 标记染色体患者的染色体附加片段来源于3q26→3qter。确定该患者的核型为46,XX,-7, der(7)t(7;3)(7pter→7q32::3q26→3qter)。应用这个策略,能够快速有效地鉴定标记染色体的来源。     

转基因猪染色体原位杂交外源生长激素基因定位

近些年来随着原位杂交技术的不断改进,该技术已广泛用于染色体的基因定位。非放射性标记探针的应用使基因定位变得更加简单易行,从而有可能对动物的转基因进行定位研究。本文首次采用胶体金标记药盒（Anti-digoxigenin-gold)和银加强试剂（Silver enhance-ment reagents)的非同位素原位杂交技术对转基因猪外基因进行了定位研究。如Fig.1所示：表达质粒pSMTPGH含有载体pUC19,羊启动子MT011和猪生长激素PGH基因。选5头带有pSMTPGH的转基因猪,分别制备含有染色体DNA的杂交膜。用BglII和Smai对pSMTPGH进行完全酶切,收集0．9kb片段作为探针,以dig-11-dUTP进行标记。探针与DNA杂交后,用光学显微镜检查。选择分散良好、显影银颗粒清楚的玻片进行摄影记录（Fig.2)。对染色体上的显影银颗粒进行统计分析,参照家猪的染色体标准带型,确定外源PGH基因整合位点。Fig.3为4104号转基因猪染色体上的银颗粒分布情况。对5头转基因猪外源PGH基因定位的结果见Table1。探针的合理设计是外源基因定位研究成功的关键。本实验所用探针必须地与外源PGH基因杂交,而不受内源PGH基因的影响。我们设计的探针符合这一要求。采用dig11－dUTP标记探针,抗体金显色,银加强试剂放大杂交信号,在光学显微镜下可以直接观察杂交位点处的显影银颗粒,但于对实验进行统计分析。估计数据表明：转基因猪的外源PGH基因随机整合在所有染色体上,但在13号染色体上的机率略高。     

花青素合成基因bz1和bz2在莲藕染色体上的定位

Bronze 1(bz1)是编码UDP葡萄糖类黄酮葡糖基转移酶(UFGT)的基因,UFGT是种子糊粉层中的花青素生物合成酶。Bronze 2(bz2)是另一种花青素生物合成基因,与类黄酮的酰化、糖基化、转运、沉积等有关。以生物素标记的重组质粒pUC19中含有玉米bz1和bz2基因作为探针,与莲藕(Nelumbo nucifera L．)的有丝分裂染色体标本进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)。结果显示,bz1和bz2基因分别位于莲藕的第2和第4号染色体长臂上,与着丝粒的相对距离分别为79％和67％。这是首次提供莲藕染色体上的FISH杂交信息,从而为增加莲藕染色体组中的遗传标记和建立遗传图谱奠定基础。     

克隆化反向杂交探针的制备

反向斑点杂交是将寡核苷酸探针固定在膜上,用标记的靶序列与固定在膜上的探针进行杂交．与正向杂交相比,它通过一次杂交即可确定多种基因型,是一种快速筛查DNA点突变的诊断方法.我们选择β－地中海贫血基因-28 (A→ G), CD17 (A→T) and CD41～42 (-TTCT) 三种点突变为模型采用PCR扩增产生串联多拷贝序列探针并将其克隆化．将克隆化探针固定于尼龙膜上,与同位素标记的β－珠蛋白基因PCR片段进行杂交,检测β－地贫患者的基因型．     

大鼠Y染色体探针的制备与鉴定

目的:研究制备地高辛标记的大鼠性别决定基因Y区(Y染色体,SRY)探针,用于检测雄性大鼠来源的细胞在雌性受鼠体内的SRY基因表达情况.方法:按已知的雄性大鼠Y染色体上性别决定基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针.以雌性大鼠为对照,原位杂交法检测大鼠肾组织切片Y染色体阳性细胞情况.结果:用原位杂交法证实在雄性大鼠肾脏内有SRY表达,而雌性大鼠肾脏无Y染色体阳性细胞,证实这种探针具有较高的敏感性和特异性.结论:大鼠性别决定基因SRY探针的制备成功,为进一步研究异体雄性大鼠细胞移植后的分布和表达提供了实验基础.     

用胞核切口转译法对人β型血珠蛋白基因的染色质结构研究

采用核切口转译改良法,对K 562细胞及HES细胞核中的人β型血红蛋白基因的染色质结构进行了分析。以~(32)P-三磷酸脱氧核苷酸作为底物,用E.coli DNA聚合酶对经。DNaseⅠ轻度消化的细胞核进行切口转译标记。然后从核中抽提出总DNA并以其为探针对经Sou-thern转移的β型血珠蛋白及其它一些基因的酶解片段进行杂交。结果表明,在K 562细胞核中,所有β型血珠蛋白基因(ε,γ,δ及β)以及18 S核糖体RNA基因均被选择性标记上了,而不表达基因:α-乳糖蛋白及c-sis基因则否。然而在HES细胞核中仅有18 S核糖体RNA基因被标记上。此表明活跃基因的染色质结构松弛,对DNase Ⅰ酶的消化较为敏感。     

双色原位杂交显示海带配子体5SrDNA与45SrDNA的非连锁关系

不等鞭毛类(stramenopiles)许多物种的报道认为,5SrRNA基因与其45SrRNA基因存在连锁关系,但通过设计不同引物进行PCR反应的探索,在海带中没有获得连锁的数据。为了从细胞学角度给予直观的证据,本研究基于海带5SrRNA及45SrRNA基因序列特征分析的基础上,利用双色荧光原位杂交(FISH)的技术和原理,以海带5SrRNA与45SrRNA基因的DNA为模板分别合成带有不同生物素荧光标记的探针,然后杂交到海带配子体的染色体上。FISH图片显示,红色标记的18S-5.8S-25S rDNA探针与绿色标记的5SrDNA探针,在同一幅海带配子体的染色体图片上都只出现了一个杂交信号;从大到小排列的核型显示,45SrDNA及5SrDNA分别定位于海带配子体的第23号和第27号染色体上,直观而清晰地表明5SrDNA并没有与45SrDNA连锁。这是首次尝试性地利用双色荧光原位杂交技术探讨藻类rDNA的染色体定位报道,这个结论有助于将FISH技术应用在海带染色体核型分析等研究。     

引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性

染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型, 经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。文章应用引物原位标记(Primed in situ labeling, PRINS)技术快速检测人类染色体非整倍性, 率先采用更新的非ddNTP阻断的多色PRINS技术, 对人类外周血淋巴细胞和精子等多种样本进行标记; 然后对不同靶标序列的标记效率及不同荧光色素的发光特点通过实验进行评估, 获得关于PRINS技术的多项反应原理参数, 并筛选标记顺序以获得均一稳定的标记效果, 最后进行临床FISH探针与PRINS的标记比较实验。通过实验比较PRINS技术与传统FISH技术之间的标记特点与差别, 评估PRINS的实际应用效果。在2.5 h内标记了同一精子核内的多条染色体, 单色以上标记达到99％。同时在人类外周血淋巴细胞中也得到较好的标记效果。与FISH技术相比, PRINS的这些优点使得它成为诊断染色体非整倍性变异的首选技术。     

用人/啮齿类体细胞杂种系及荧光原位杂交将人类新基因ZNF191定位于染色体18q12.1

本文以锌指蛋白ZNF191全长cDNA为探针,与人/啮齿类体细胞杂种系DNA杂交,将这个新的人类锌指基因定位于18号染色体。又用该cDNA筛选人基因组DNA lambda/DASH文库,以获得的DNA片段为探针,进行人染色体荧光原位杂交(FISH)分析,将ZNF191基因精细定位在染色体18q 12.1区带。依据有关遗传连锁分析和等位基因荧光原位杂交(FISH),将ZNF191精确定位于人染色体18q12.1。通过遗传连锁及染色体杂合性丢失分析.目前已知多种遗传病和肿瘤与这个区域相关。因此,ZNF191基因可作为这些疾病或肿瘤的候选相关基因。     

转pGH基因猪外源基因染色体定位研究

应用地高辛标记探针对转pGH基因(猪生长激素基因)猪染色体进行原位杂交,经胶体金抗体、银增强放大系统检测外源pGH基因在染色体上的整合位点。研究表明,转基因阳性个体间外源基因整合位点存在差异,但对个体而言,外源基因总是集中分布于某一特定的染色体上。本研究将为探究外源基因整合位点与其表达效率的关系及今后定点整合的研究提供理论指导。     

薄片牡蛎的核型及18S-28S核糖体rRNA基因的染色体定位

以薄片牡蛎(Dendostrea folium)成体鳃组织为材料制备有丝分裂中期染色体标本,对其染色体核型进行了分析,并运用荧光原位杂交技术(FISH)将18S-28S核糖体RNA基因定位于中期染色体上。FISH探针是通过PCR扩增介于18S-28S rRNA基因之间的ITS和5.8S rRNA基因序列,并在PCR扩增过程中掺入了Biotin-11-dUTP进行生物素标记。结果显示,薄片牡蛎的单倍染色体数目为n=10,全部为中部着丝粒染色体。与大多数已知巨蛎属牡蛎的染色体核型相似。ITS探针在薄片牡蛎中期分裂体相上产生两簇FISH信号,分别杂交于2号染色体短臂的近端粒区域。本研究首次报道了薄片牡蛎的中期染色体核型以及18S-28S核糖体RNA基因在染色体上的定位。     

用原位杂交法定位猪乳铁蛋白基因于染色体2q12

本研究以非放射性标记的猪乳铁蛋白(Porcine Lactoferrin简称PLF)cDNA 为探针,通过染色体原位杂交法,对PLF基因进行了染色体定位。实验中采用金胶抗体技术并结合使用银增强系统,提高了方法的灵敏度。利用染色体的组型分析,对杂交点的分布进行统计学分析。52%(26/50)的分裂相在第2号染色体具银粒分布,实验结果表明：PLF基因定位于猪2号染色体2q¹²区域。     

花青素合成基因bz1和bz2在莲藕染色体上的定位

Bronze 1(bz1)是编码UDP葡萄糖类黄酮葡糖基转移酶(UFGT)的基因,UFGT是种子糊粉层中的花青素生物合成酶。Bronze2(bz2)是另一种花青素生物合成基因,与类黄酮的酰化、糖基化、转运、沉积等有关。以生物素标记的重组质粒pUC19中含有玉米bz1和bz2基因作为探针,与莲藕(Nelumbonucifera L. )的有丝分裂染色体标本进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)。结果显示,bz1和bz2基因分别位于莲藕的第2和第4号染色体长臂上,与着丝粒的相对距离分别为79%和67%。这是首次提供莲藕染色体上的FISH杂交信息,从而为增加莲藕染色体组中的遗传标记和建立遗传图谱奠定基础。     

ND-FISH技术在两栖类中的应用

非变性荧光原位杂交(ND-FISH)是近年来兴起的一种技术,一般使用带有荧光标记的简单序列重复(SSRs)作为探针,杂交中不需要进行探针和染色体的变性使得检测简单快捷。SSRs探针可检测出染色体上SSR富集的区域,可以帮助辨识染色体,SSRs分布的多态性还可以为遗传多态性的研究提供信息。(1)该研究首次将ND-FISH运用于两栖动物中,得到了5个可运用于多态性研究的标记。(2)研究发现,有别于其他类群,当ND-FISH应用于两栖动物时,染色体标本必须进行变性。(3)该研究还对双色荧光原位杂交流程进行了较大的改进,在一个杂交体系中同时使用直接和间接标记探针,通过一次实验获得双色信号,从而使步骤简化。     

动物遗传工程

921940大鼠生长激紊基因微注射到斑马鱼卵里以生产转基因斑马鱼〔英〕/Pandian,T.J.…泌Curr.Sei一1991,60一9~10〔译自DBA,1991,10(22),91一13024〕 将质粒pMGH(15ng DNA/时)(含有与大鼠生长激素基因融合的小鼠金属硫因启动子)微注射到斑马鱼尚未分裂的受精卵(1266个)里。注射一天后胚胎平均存活率为46%,但变动范围为16~72%。利用标记质粒作探针通过Slot一blot和Sou-thern印迹杂交分析了从推定转基因鱼提取出的基因组DNA。杂交图谱显示发生了基因组、染色体外、以及嵌合整合。继续存在于Fl和FZ代里的染色体外DNA浓度逐步降低。F…     

基因库构建

922884直接偏选含YAC克隆的cosmid文库〔英〕/Bax“-ndale,5.…/Nueleio Aeids Res一i。。1,1。 (25)一6651〔译自DBA,1992,11(4),92-01865〕 介绍了直接筛选含人类人造染色体(HAC)的cosmid基因文库的方法。从48XXXX人类细胞系的酵母人造染色体(YAC)基因文库中分离出重叠YAC克隆〔YGAS(41okb)和YGAio(4‘okb)〕,置于亨廷顿舞蹈病基因4 p16。3候选区内在紫外光下(36Onm)从凝胶上的酵母染色体带中切下HAC带。用(a一‘ZP)一dGTP和一dATP对D NA进行随机引物标记。通过与人切变胎盘DNA预杂交,从探针和经流式分拣的人第4染色…     

利用染色体区段混合BAC探针鉴定食管癌细胞中的染色体畸变

染色体畸变是恶性肿瘤细胞的重要遗传学特征, 文章旨在应用BAC DNA克隆鉴定食管癌细胞中的染色体臂和染色体区段的畸变。针对染色体各区段选取5~10个1 Mb BAC DNA, 分别混合制备成特定染色体区段的BAC DNA混合克隆, 然后将染色体臂上覆盖所有区段的上述混合克隆进一步混合制备成特定染色体臂BAC DNA混合克隆。利用简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(Degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)标记染色体臂探针, 利用切口平移法(Nick translation)标记染色体区段探针, 并对食管癌细胞中期染色体进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)分析。正常人外周血淋巴细胞中期染色体FISH结果显示, 上述方法标记的探针具有较高的特异性。进一步利用染色体臂混合探针, 确定了多个食管癌细胞中的染色体重排所涉及的特定染色体臂; 利用染色体区段混合探针, 鉴定出KYSE140的t(1q;7q)衍生染色体中1q上的断点范围位于1q32-q41。文章成功建立了1 Mb BAC DNA混合克隆探针标记技术, 并鉴定出多个食管癌细胞中的染色体臂和染色体区段畸变, 不仅为利用M-FISH技术鉴定肿瘤细胞中的染色体畸变提供了更为准确的方法, 而且还可能进一步将该法推广应用于恶性血液病的核型分析以及产前诊断。