农杆菌介导淀粉分支酶基因RNAi片段转化玉米的研究

以玉米自交系“178”和“R18红”的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对潮霉素的敏感性实验,确定了潮霉素15 mg/L~25 mg/L为愈伤组织适宜的选择压。利用农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)介导将淀粉分支酶基因RNA干涉表达载体转入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行研究。结果表明:在感染液和共培培养基中分别都加入100μm ol/L乙酰丁香酮和50 mg/L抗坏血酸,农杆菌LBA4404的菌液OD600为0.6、侵染时间20 m in为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,转化率最高达到2.4%。     

农杆菌介导的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）转化金针菇的研究

构建了金针菇表达载体p139035S-bFGF,并将重组质粒转入到根癌农杆菌EHA105中。以白金针菇Flammulina velutipes菌丝球为受体材料,用根癌农杆菌介导转入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。金针菇菌株对潮霉素（Hyg）抗性测验结果表明,在PDA固体培养基上的潮霉素筛选浓度为9μg/mL,在液体培养基中为6μg/mL。探索头孢霉素（Cefotaxime）对菌丝的毒性实验、农杆菌的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）的添加及其浓度的控制、共培养的时间等因素对转化效率的影响。结果表明,Cef对金针菇菌丝几乎无抑制作用,最佳抑菌浓度为400μg/mL;农杆菌的菌液浓度OD600为0.5,侵染时间在30min左右,在AS为200μmol/L的共培养基上共培养72h,转化率最高。PCR与Southern杂交结果证明bFGF基因已整合到金针菇的基因组中。在无选择压力的PDA固体培养基上继代培养5次后仍检测到bFGF基因的存在,表明bFGF基因在转基因金针菇中稳定遗传。     

农杆菌介导的马尔尼菲青霉基因转化技术的建立及优化

目的建立农杆菌介导的马尔尼菲青霉(PM)基因转化技术,并对该技术条件进行优化。方法以二元质粒p DHt/SK为载体,通过农杆菌介导将pyr G基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株SPM4(pyr G-,nia D-)中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子。运用PCR验证重组子。进一步对影响转化效率的农杆菌类型、共培养浓度、转化媒介、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等六个条件进行优化。结果 PCR验证pyr G基因成功的插入SPM4中,所得到转化子可稳定传代,通过条件优化,得到转化子约300个/106个细胞。选用AGL-1,以农杆菌共培养浓度为OD600=0.8,AS浓度为200μmol/L,无膜IM固体共培养基为介质,25℃共培养48 h为最适转化条件。结论成功建立了农杆菌介导PM基因转化技术,简化并优化了转化条件,该方法可用于PM基因功能研究。     

农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究

以玉米自交系郑58的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中,研究以茎尖为受体的农杆菌转化体系的可行性。98株转化苗,经过300 ppm的除草剂(农达)筛选,共获得13株转基因植株,经PCR检测,其中7株表现阳性,转化率达7.14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。     

农杆菌介导的Pr基因对非洲菊遗传转化的研究

采用农杆菌介导法将Pr基因转入非洲菊(Gerbera hybrida),建立适合于农杆菌介导的基因遗传转化受体系统,获得再生植株。经PCR和GUS染色检测,Pr基因成功转入非洲菊幼苗。     

农杆菌介导的棉花枯萎病菌转化体系的优化

【背景】海岛棉相对陆地棉更易感枯萎病,一旦发生很难根治,使得枯萎病逐渐成为威胁新疆海岛棉产业发展的主要病害,但其致病机理目前还不是十分明确。【目的】揭示棉花枯萎病菌的遗传变异和致病机理,同时获得带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记的棉花枯萎病菌转化子用于观察其侵染海岛棉的途径。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation,ATMT)方法,对棉花枯萎病菌7号生理小种st89进行了遗传转化并对转化条件进行优化。【结果】农杆菌介导的遗传转化法转化棉花枯萎病菌的最佳条件为:150 mg/L的潮霉素浓度能完全抑制棉花枯萎病菌的生长,浓度为200 mg/L的头孢噻肟钠能完全抑制农杆菌LBA4404生长,农杆菌起始浓度OD_(600)为0.2,农杆菌预培养时间为8 h,棉花枯萎病菌分生孢子浓度为10~5个/mL,枯萎病菌孢子悬液和农杆菌LBA4404比例为1:1,乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL,共培养时间为4 d,转化后培养温度25℃。利用优化的转化系统将GFP基因转入到棉花枯萎病菌中,转化效率最高可以达到252±7.37个转化子/10~5个孢子。PCR扩增以及荧光观察表明GFP基因能够正常表达。【结论】转GFP基因的枯萎病菌的获得为深入研究棉花枯萎病入侵的机理奠定了基础。     

农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系的建立

以刺芹侧耳菌丝球为受体,潮霉素（Hyg）为筛选标记,应用农杆菌介导法对刺芹侧耳菌丝进行了遗传转化研究。潮霉素敏感性测试结果表明,刺芹侧耳Hyg耐受浓度为50mg/L。农杆菌介导的刺芹侧耳菌丝最佳遗传转化体系为：菌液浓度OD₆₀₀=0.6-0.7,侵染时间30-35min,共培养时间2d,侵染液和共培养培养基中乙酰丁香酮（AS）浓度为1mg/mL;经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和GUS活性的组织化学分析,表明外源基因GUS已转入到刺芹侧耳菌丝中,并获得表达。本实验成功地建立了稳定的农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系。     

柑桔基因转化新方法的研究

尽管应用基因转化进行果树品种改良已日益引起重视,但是在受体的应用和转化方法上还存在着诸多困难。一方面,大多数果树尚不能从细胞或原生质体再生成完整植株,即使少数已可以再生的果树树种,也并非众多品种都能再生成功,而是存在着明显的基因型差异性。同时,还有再生植株童期过长的问题。另一方面,目前在植物基因转化中常用的两种方法即DNA直接吸入法和农杆菌介导的载体法,若以细胞或原生质体为受体,不仅存在再生困难的问题,而且再生过程费时长;若以叶盘、愈伤组织或珠心组织等为受体,既需要在转化后除去农杆菌,又需要排除转化与非转化组织的嵌合性。这些因素都大大地限制了基因转化在果树中的应用。因此,根据多年生果树的生长特点,建立一种适用的基因转化技术已成当务之急。本文采用农杆菌介导的附体腋芽转化-离体扩繁鉴定的方法,成功地将GUS基因转入沙田柚。结果证明这是一种简单、快速、高效的基因转化方法。     

影响农杆菌介导的柑桔基因转化因素研究

以柑桔（ Ｃｉｔｒｕｓ） 中的枳壳、甜橙、柠檬、四季桔上胚轴为对象, 进行了农杆菌介导的柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因转化影响因素研究, 最终将衰退病病毒外壳蛋白基因转入枳壳。研究结果表明： 以卡那霉素为选择试剂, 且外植体水平放置时, 枳壳的选择浓度为５０μｇ／ｍＬ, 其它品种为２０ ～３０μｇ／ｍＬ。外植体与农杆菌的共培养时间３ ｄ 最好, ７０ ～１００μｍｏｌ／Ｌ的酚类化合物（Ａｓ） 的添加对外植体Ｇｕｓ 瞬时表达阳性率有明显促进作用。转化所用外植体年龄以２０ ｄ 最好, 品种之间抗性芽产生率与Ｇｕｓ 阳性芽产生率明显不同。以质粒ＤＮＡＮｃｏⅠ酶切产物为探针, 进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析, 结果表明外源基因已稳定整合到了枳壳植株的核基因组中。     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因…

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ｔｉ质粒转化材料,利用共培养法将苏云杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现：８００μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可转将化效率提高５０倍。     

农杆菌介导的枳壳转化系统建立研究初报

以枳壳为对象 ,进行了农杆菌介导的上胚轴转化系统建立研究 ,得到了携带柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因的枳壳转化植株。研究表明 :枳壳各类外植体中 ,上胚轴是较好的转化材料 ;上胚轴出芽部位主要在形态学上端。以卡那霉素为选择剂 ,外植体水平面放置时 ,选择剂的剂量是 50～ 70mg/ L。转化研究中发现感染液中乙酰丁香酮 10 0μmol/ L的加入促进转化外植体 Gus表达阳性率的提高。延迟 1a的选择培养 ,有助于 Gus阳性芽的增多。所得 Gus阳性无性系经 Southern blot杂交检测 ,证明外源基因已稳定整合到了植物基因组中 ,所得 Gus阳性植株确为携带柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因的转化植株     

农杆菌介导红江橙遗传转化的研究初报

用红江橙实生苗的上胚轴为材料 ,初步研究以根癌农杆菌介导的 GUS基因转化。结果表明 :以卡那霉素作为选择试剂进行选择培养时 ,Km浓度为 5 0 mg/L;外植体以平放为好 ;抑菌剂选择头孢霉素较好。GUS基因瞬时表达检测 ,70 .4%的外植体呈阳性反应 ;GUS基因稳定表达检测 ,在获得的 1 2株抗性植株中 ,GUS反应呈阳性所占比例为 1 6.7%。     

枳壳外植体离体再生及农杆菌介导的遗传转化

以枳壳实生苗的上胚轴及茎段为材料,在附加有ＢＡ和ＭＴ培养基上进行培养,上胚轴出芽率普遍高于茎段,ＢＡ为１ｍｇ／Ｌ时,出芽率最高,ＢＡ浓度升高,出芽率随之下降。外植体在培养基上的接种方式,对出芽有一定影响,上胚轴切段 形态学下端垂直插入,出芽率高。     

Agrobacterium-mediated transformation of cotyledonary explants of Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis)

 A procedure for producing transgenic Chinese cabbage plants by inoculating cotyledonary explants with Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 carrying a binary vector pIG121Hm, which contains kanamycin-resistance and hygromycin-resistance genes and the GUS reporter gene, is described. Infection was most effective (highest infection frequency) when explants were infected with Agrobacterium for 15 min and co-cultivated for 3 days in co-cultivation medium at pH 5.2 supplemented with 10 mg/l acetosyringone. Transgenic plants of all three cultivars used were obtained with frequencies of 1.6–2.7% when the explants were regenerated in shoot regeneration medium solidified with 1.6% agar. A histochemical GUS assay and PCR and Southern blot analyses confirmed that transformation had occurred. Genetic analysis of T1 progeny showed that the transgenes were inherited in a Mendelian fashion. Received: 15 December 1998 / Revision received: 2 July 1999 · Accepted: 8 July 1999     

Agrobacterium-mediated transformation of bottle gourd (Lagenaria siceraria Standl.)

We describe a procedure for producing transgenic bottle gourd plants by inoculating cotyledon explants with Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 that carries the binary vector pCAMBIA3301 containing a glufosinate ammonium-resistance (bar) gene and the beta-D-glucuronidase (GUS) reporter gene. The most effective bacterial infection was observed when cotyledon explants of 4-day-old seedlings were co-cultivated with Agrobacterium for 6-8 days on co-cultivation medium supplemented with 0.1-0.001 mg/l L-alpha-(2-aminoethoxyvinyl) glycine (AVG). The putatively transformed shoots directly emerged at the proximal end of cotyledon explants after 2-3 weeks of culturing on selection medium containing 2 mg/l DL-phosphinothricin. These shoots were rooted after 3 weeks of culturing on half-strength MS medium containing 0.1 mg/l indole acetic acid and 1 mg/l DL-phosphinothricin. Transgenic plants were obtained at frequencies of 1.9%. Stable integration and transmission of the transgenes in T1 generation plants were confirmed by a histochemical GUS assay, polymerase chain reaction and Southern blot analyses. Genetic segregation analysis of T1 progenies showed that transgenes were inherited in a Mendelian fashion. To our knowledge, this study is the first to show Agrobacterium-mediated transformation in bottle gourd.     

Insect-resistant transgenic cabbage plants and their progenies

An insecticidal crystal protein gene of Bacillus thuringiensis was transferred into cabbage genome with the method of Agrobacterium infection. Cotyledons with petioles as explants were cocultivated with Agrobacterial suspension. Calli generated at the basis of petiole were subjected to selection on the MS medium containing 15-30 mg/L kanamycin (Km). About 5% explants produced calli growing continuously on the selective medium. Green shoots appeared on these calli when they were transplanted onto medium with Km and 6-BA for plant differentiation. The shoots were separated and cultivated on medium with kanamycin. About 80% shoots were rooted. Non-transformed control calli could not give normal shoots and roots and brownized and died gradually. Larvae of Pieris rapae showed poisonous symptoms: growth inhibition and mortality when fed with the leaf of the transgenic plants. About 80% of regenerated plants showed positive hybridization bands when their DNA were probed with crystal protein sequence of Bacillu     

PSAG12-ipt嵌合基因转化马铃薯体系的研究

以根癌农杆菌介导法将PSAG12-ipt嵌合基因导入马铃薯栽培品种,对影响马铃薯遗传转化的多种因素进行系统研究.结果表明:马铃薯茎段分化效率高于叶片,马铃薯愈伤诱导和芽分化最适培养基为MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+2,4-D 0.25mg/L,添加1%Na2SO3能有效防止褐化;茎段愈伤诱导和分化苗生根最适的Kan浓度分别为50mg/L和75mg/L;外植体预培养2d,OD600为0.2～0.5的农杆菌浓度侵染8min、共培养3d后进行选择培养能有效地提高植株再生能力.用PSAG12和ipt双重PCR检测再生植株,阳性转化率为65.8%.Southern blotting结果表明,转基因植株多以单拷贝形式整合进马铃薯基因组中.     

根癌农杆菌介导的高效大豆遗传转化体系的建立

利用根癌农杆菌对来自大豆成熟种子的胚尖进行遗传转化,研究了影响农杆菌介导大豆转化的各种因素,建立了一套优化的大豆遗传转化体系。研究结果表明:菌株KYRT1比EHA105和LBA4404具有更强的侵染能力;较酸的共培养基(pH5.4)、较低的培养温度(22℃)均有利于提高转化效率;恢复培养和分步抗性筛选方式有利于提高抗性组织的存活率和分化率。同时应用这种优化的遗传转化体系,获得了7个大豆品系的转基因植株,转化频率为4.29%-18%。经过PCR和Southern分析证明外源的双价抗虫基因cryIA(c)和pta已经整合到大豆的基因组中。     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化番茄的研究

构建AtNHX1基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将其转入番茄。探讨了外植体类型、农杆菌菌株和不同筛选标记对芽诱导分化的影响。对抗性植株进行PCR检测,获得15株转基因植株。对转基因番茄T1代进行80mmol/LNaHCO胁迫处理,转基因植株的相对生长量高于对照植株,显示AtNHX1基因的导入提高了番茄对碱性盐的耐受性。     

农杆菌GV3101中反式玉米素合成基因促进烟草再生

胭脂碱型农杆菌GV3101已经被广泛用于植物遗传转化研究。已有的研究结果证明,农杆菌GV3101株系含有的反式玉米素合成 (trans-zeatin synthesizing,tzs)基因编码产物会影响烟草细胞器的形态及细胞的生理状态。然而,有关tzs基因对遗传转化过程外植体再生的影响研究却少有报道。本文在前期研究工作的基础上,以2种烟草、4个农杆菌株系为组培实验材料,验证了胭脂碱型农杆菌tzs基因产物的生理活性。结果表明：以外源添加生长调节物质的外植体为阳性对照,在不添加任何生长调节剂的培养基上,与GV3101菌株共培养的烟草外植体能分化再生,并发育成完整植株;外植体再生与GV3101携带的质粒种类无关;外植体与农杆菌GV3101培养液共培养24 h,烟草再生效果较好;与GV3101株系共培养24 h,将外植体烟草叶片匀浆,经亲和柱分离纯化后,检测出烟草外植体叶片中高达0.78 ng/g FW-1的反式玉米素含量。菌落PCR扩增结果证实,农杆菌GV3101株系有tzs基因序列。以上结果表明,农杆菌GV3101株系内的tzs基因的表达产物有生理学活性,能够促进烟草外植体再生,调节细胞生长。