农杆菌介导的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）转化金针菇的研究

构建了金针菇表达载体p139035S-bFGF,并将重组质粒转入到根癌农杆菌EHA105中。以白金针菇Flammulina velutipes菌丝球为受体材料,用根癌农杆菌介导转入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。金针菇菌株对潮霉素（Hyg）抗性测验结果表明,在PDA固体培养基上的潮霉素筛选浓度为9μg/mL,在液体培养基中为6μg/mL。探索头孢霉素（Cefotaxime）对菌丝的毒性实验、农杆菌的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）的添加及其浓度的控制、共培养的时间等因素对转化效率的影响。结果表明,Cef对金针菇菌丝几乎无抑制作用,最佳抑菌浓度为400μg/mL;农杆菌的菌液浓度OD600为0.5,侵染时间在30min左右,在AS为200μmol/L的共培养基上共培养72h,转化率最高。PCR与Southern杂交结果证明bFGF基因已整合到金针菇的基因组中。在无选择压力的PDA固体培养基上继代培养5次后仍检测到bFGF基因的存在,表明bFGF基因在转基因金针菇中稳定遗传。     

角质细胞生长因子2基因(KGF2)的克隆及其对油菜的遗传转化

近年来,植物表达人源蛋白的研究逐渐增多。本研究以人角质细胞生长因子(KGF2)基因cDNA为基础,根据植物偏好密码子进行改造,并利用PCR方法合成KGF2基因全长cDNA。在此基础上构建了KGF2的植物油体系统表达载体p1390-YO-KGF2,并采用农杆菌介导法对甘蓝型油菜无菌苗的子叶进行转化。通过PCR、Southern杂交和Western blotting检测,证明外源基因KGF2已经转入油菜中并得到成功表达。     

全氟辛烷磺酸盐对胚胎期大鼠雄性生殖系统的影响

目的:研究全氟辛烷磺酸盐(PFOS)对胚胎期大鼠雄性生殖系统发育的影响.方法:PFOS分别以5、10、20 mg· kg-1·d-1灌胃染毒孕12-19天的SD母鼠,染毒结束后,测量雄性胎鼠体重、身长、睾丸重量、AGD;酶联免疫吸附法检测雄性胎鼠睾丸内睾酮水平;实时荧光定量PCR法测睾丸组织类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胰岛素样因子3(INSL3)mRNA的相对表达量.结果:与对照组相比,高剂量染毒组雄性胎鼠体重、体长、AGD长度显著降低(P＜0.01),睾丸重量减轻(P＜0.05);高剂量染毒组雄性胎鼠睾丸中内睾酮水平下降(P＜0.05);高剂量染毒组雄性胎鼠睾丸组织中StAR mRNA的表达量降低(P＜0.05),而中剂量染毒组StAR mRNA和INSL3 mRNA表达量则明显升高(P＜0.01).结论:孕期染毒PFOS对雄性胚胎生殖系统的发育有毒性作用,其机制可能与PFOS影响睾酮合成和INSL3 mRNA的表达有关.     

重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用研究

目的:研究截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用。方法:取含有重组截短型TGF-βⅡ型受体载体的大肠杆菌BL21,通过培养繁殖,诱导,纯化得到重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。使用CCl4诱导的方法来制备肝纤维化大鼠模型,观察截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的影响。SDS-PAGE检测纯化的截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。生化检测血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)及谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)含量。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法和免疫荧光方法来检测各组大鼠肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA),1型胶原(collagen1,Col1)和4型胶原(collagen4,Col4)的表达情况。用HE,MASSON,PAS这三种病理学染色的方法来观察各组大鼠肝纤维化的变化。结果:SDS-PAGE检测结果显示,纯化后获得高纯度截断型TGF-βⅡ型受体蛋白。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以减少血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以降低肝组织中α-SMA、FN、Col1和Col4的mRNA和蛋白质的表达。三种病理学染色的方法显示,与肝纤维化大鼠模型组相比,治疗组的纤维化程度明显减轻。结论:重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的程度有抑制作用,为治疗肝纤维化及其他纤维化疾病提供了一个潜在的治疗手段。     

miR-23b通过靶定TAB2/3抑制糖尿病肾病纤维化

MicroRNAs(miRNAs)通过与靶基因的相互作用发挥其生物学功能. miR-23b作为抑癌基因,参与了许多肿瘤和自身免疫疾病的发生过程,但其在糖尿病肾病中的作用尚不清楚.为了探讨miR-23b与靶基因TAB2/3作用对糖尿病肾病纤维化的影响,本实验通过建立糖尿病小鼠模型和糖尿病HK-2细胞模型,利用实时定量荧光PCR方法,检测糖尿病小鼠模型肾mRNA表达,发现miR-23b在糖尿病组（Dia组）表达低于正常组（P<0.001）.利用Western印迹检测相关蛋白,结果显示,与正常组相比,TAB2/3,FN和α-SMA在糖尿病组高表达,并且TAB2/3在糖尿病组中持续高表达.利用基因转染技术过表达miR-23b可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制TAB2/3,P38和ERK1/2的表达,FN表达也显著降低.以上结果显示：miR-23b可能通过作用靶基因TAB2/3及其信号通路下游,抑制糖尿病肾病纤维化.