工程菌种自动化高通量编辑与筛选研究进展

合成生物学(synthetic biology)与经典生物学研究的革命性区别之一是合成生物学能将生物实验的对象、方法、技术和流程高度标准化和模块化,创建出自动化与高通量的合成生物铸造模式。该模式通过复杂生物过程与自动化设施的结合,颠覆过往劳动密集型的研究范式,获得更高的技术迭代能力,极大促进了合成生物学的发展和产业化应用。值此天津工业生物技术研究所创立10周年之际,本文回顾了研究所在工业菌种自动化高通量编辑与筛选领域的系列重要工作进展,对基因克隆(gene cloning)、基因组编辑(genome editing)、编辑序列设计(editing sequence design)等生物技术的自动化实现,以及流式细胞、液滴微流控、全基因组规模扰动测序等高通量筛选技术进行了分析讨论,并展望了本领域未来的发展方向。望借此为创建具有自主知识产权的优秀菌种及其产业应用提供智能化、自动化和全链条覆盖的整体支撑能力。     

谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势。目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱基编辑工具,并实现了两基因和三基因的同时编辑。文中针对谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统中存在的不足(多重sgRNA结构烦琐、重复序列干扰、更换靶点困难等),采用多种策略进行优化,并比较碱基编辑效率:首先优化基于单独启动子/终止子的多重sgRNA表达框,通过构建框架质粒,并结合Golden Gate连接方法,加速靶点更换,避免重复序列干扰,虽然该方法 sgRNA结构烦琐,但编辑效率最高;同时,开发基于Type ⅡCRISPR crRNA阵列、tRNA加工的多重gRNA表达框,这两种形式均只需要一个启动子和一个终止子序列,极大地简化了表达框结构,虽然编辑效率均出现下降,但仍具有一定的实用性。该研究丰富了谷氨酸棒杆菌的基因组编辑工具,为该菌株的遗传改...     

谷氨酸棒杆菌碱基编辑的条件优化

近年来,基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势,已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具,在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH,为进一步优化该方法,提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率,本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白(GFP)的检测系统:将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG,GFP无法正常表达,当该密码子的C经编辑后恢复为T,即实现GFP蛋白的复活,结合流式细胞仪分析技术,可快速衡量编辑效率。然后,构建针对靶标位点的碱基编辑工具,经测试,该位点可成功被编辑,在初始编辑条件下碱基编辑效率为(13.11±0.21)%。在此基础上,通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化,确定最优编辑条件是:培养基为CGXII,初始OD600为0.05,诱导时间为20 h,IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化,编辑效率达到(30.35±0.75)%,较初始条件提高了1.3倍。最后,选取原编辑条件下编辑效率较低的位点,进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估,结果显示,不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍,进一步证实该优化条件的有效性及通用性。研究结果为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更好的应用提供了重要的参考价值。     

农杆菌介导的棉花枯萎病菌转化体系的优化

【背景】海岛棉相对陆地棉更易感枯萎病,一旦发生很难根治,使得枯萎病逐渐成为威胁新疆海岛棉产业发展的主要病害,但其致病机理目前还不是十分明确。【目的】揭示棉花枯萎病菌的遗传变异和致病机理,同时获得带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记的棉花枯萎病菌转化子用于观察其侵染海岛棉的途径。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation,ATMT)方法,对棉花枯萎病菌7号生理小种st89进行了遗传转化并对转化条件进行优化。【结果】农杆菌介导的遗传转化法转化棉花枯萎病菌的最佳条件为:150 mg/L的潮霉素浓度能完全抑制棉花枯萎病菌的生长,浓度为200 mg/L的头孢噻肟钠能完全抑制农杆菌LBA4404生长,农杆菌起始浓度OD_(600)为0.2,农杆菌预培养时间为8 h,棉花枯萎病菌分生孢子浓度为10~5个/mL,枯萎病菌孢子悬液和农杆菌LBA4404比例为1:1,乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL,共培养时间为4 d,转化后培养温度25℃。利用优化的转化系统将GFP基因转入到棉花枯萎病菌中,转化效率最高可以达到252±7.37个转化子/10~5个孢子。PCR扩增以及荧光观察表明GFP基因能够正常表达。【结论】转GFP基因的枯萎病菌的获得为深入研究棉花枯萎病入侵的机理奠定了基础。     

三角洲平原水库堤坝土壤水和可溶性盐空间分布特征

以辽宁省大洼县三角洲平原水库坝体不同坡向、坡位、剖面深度的土壤为研究对象,分析了土壤含水率和可溶性盐总量在水平空间与垂直空间上的变异与分布特征。结果表明:与含水率相比,土壤可溶性盐总量的变异相对较高;二者均为中等变异性且变异性的趋势较一致。坝体南坡土壤的平均可溶性盐总量、平均含水率均大于北坡。不同土层之间平均可溶性盐总量从大到小的顺序为:中层>下层>表层;而平均含水率随土壤剖面深度增加而增加。不同坡位间可溶性盐总量没有显著性差异;上坡位与中坡位的平均含水率基本持平,下坡位最高。研究结果可为辽河三角洲地区平原水库堤坝及其周边盐碱土治理与植被恢复提供依据。     

鸡眼草水浸提液对4种草坪草的化感作用

为探讨鸡眼草(Kummerowia striata)不同部位、不同浓度水浸提液对高羊茅(Festuca arundinacea)、黑麦草(Lolium perenne)、狗牙根(Cynodon dactylon)、白三叶(Trifolium repens)等4种草坪草的化感效应和作用规律,采用培养皿纸床法,以蒸馏水为对照,研究鸡眼草剪碎的植株、未剪碎的植株、叶、茎、根、地上部分0.012 5、0.025、0.05 g/mL 3个不同浓度的水浸提液对高羊茅、黑麦草、狗牙根、白三叶的种子发芽率、发芽速率、幼根长、幼苗高的化感作用。结果表明,鸡眼草水浸提液对高羊茅、黑麦草、狗牙根、白三叶4种受体植物种子的萌发及幼苗生长均有较强的化感抑制作用,且对种子发芽率作用强弱顺序为:狗牙根白三叶黑麦草高羊茅,对种子发芽速率作用强弱顺序为:黑麦草高羊茅狗牙根白三叶,对幼苗苗高作用强弱顺序为:黑麦草白三叶狗牙根高羊茅,对幼苗根长作用强弱顺序为:白三叶黑麦草狗牙根高羊茅。对4种受体植物的综合化感效应以高羊茅最弱,黑麦草、狗牙根、白三叶较为相近。4种受体植物所受到的抑制作用均随着水浸提液浓度的增加而增强,在同一浓度不同部位水浸提液处理下,叶、整株(剪碎)水浸提液对4种受体植物抑制作用比根、茎、整株(未剪碎)及地上部分水浸提液强。高羊茅、黑麦草、狗牙根3种草坪草受0.05 g/mL鸡眼草叶水浸提液的化感抑制作用最强,白三叶则受0.05 g/mL鸡眼草整株(剪碎)水浸提液的化感抑制作用最强。     

代谢工程改造酿酒酵母合成葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是一种高附加值的有机酸,广泛用于食品、医药和化工领域。为获得生产葡萄糖二酸的微生物细胞工厂,通过共表达小鼠来源的肌醇加氧酶(MIOX)及恶臭假单胞菌来源的醛酸脱氢酶(Udh),在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C中构建了葡萄糖二酸合成途径,产量为(28.28±3.15)mg/L。在此基础上,通过调控前体肌醇的合成途径,发现肌醇-1-磷酸合成酶(INO1)是葡萄糖二酸合成途径的限速酶,过量表达INO1,葡萄糖二酸产量达到(107.51±10.87)mg/L,提高了2.8倍。进一步弱化竞争支路中磷酸果糖激酶(PFK1)的表达,最终葡萄糖二酸的产量达到(230.22±10.75)mg/L,为进一步获得高产葡萄糖二酸细胞工厂提供基础。     

棉花枯萎病菌突变体库的构建及分析

[背景]棉花枯萎病逐渐成为威胁新疆海岛棉产业发展的主要病害,但关于棉花枯萎病菌的致病力、产孢量、生长速度及颜色变化等相关功能基因目前还不是十分明确.[目的]通过构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记棉花枯萎病菌突变体库,筛选出由于T-DNA的随机插入而导致性状发生变异的突变体...     

miR-186-5p在酒精诱导的心肌细胞中高表达并通过靶基因XIAP调控细胞凋亡水平

目的:证实酒精可诱导AC16心肌细胞凋亡及其与酒精浓度和作用时间的关系,研究不同浓度酒精干预下AC16心肌细胞中miR-186-5p与X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达水平以及心肌细胞凋亡水平的改变,探究miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。方法:流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot、实时定量PCR技术分别在蛋白质及基因水平检测细胞miR-186-5p与XIAP表达水平的变化,双萤光素酶报告基因靶基因荧光检测miR-186-5p与XIAP的靶际关系。结果:酒精诱导AC16心肌细胞发生凋亡,且与酒精浓度及作用时间呈正相关;酒精摄入上调AC16心肌细胞中miR-186-5p表达,下调XIAP表达; miR-186-5p参与酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡过程,XIAP抑制酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡; miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。结论:AC16心肌细胞经过酒精处理后,细胞的凋亡水平升高,并且随着酒精作用浓度和作用时间的延长,凋亡水平进一步升高;酒精处理后心肌细胞中miR-186-5p表达量上调,XIAP表达量下调,miR-186-5p以XIAP为靶基因,调控酒精处理后心肌细胞的凋亡。     

非洲白参的抗氧化活性及其化学成分研究

采用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）自由基清除法和FRAP（铁离子还原/抗氧化能力）法对非洲白参（Mondia whiteii（Hook.f.）Skeels）不同萃取部位的抗氧化活性进行分析,然后采用紫外分光光度法和福林酚比色法分别测定非洲白参不同萃取部位的总黄酮、总酚含量,最后采用大孔树脂AB-8、ODS以及Sephadex LH-20柱层析和半制备型HPLC等色谱分离技术对其二氯甲烷萃取部位的化学成分进行分离、纯化。结果显示：非洲白参二氯甲烷萃取部位抗氧化活性最高,且二氯甲烷萃取部位的总酚含量远高于其他部位;化学成分分离、纯化后得到10个单体化合物,分别为：2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（1）、秦皮素（2）、7-甲氧基香豆素（3）、α-羟基丁香丙酮（4）、ω-hydroxypropioguaiacone（5）、桂皮酸（6）、水杨酸（7）、4-甲氧基水杨酸（8）、丁香酸（9）、壬二酸（10）。其中,化合物3~10为首次从该植物中分离得到。