Ad-Ang1-IRES-VEGF165腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的:构建人血管生成素1(Ang1)和血管内皮生长因子VEGF165 (VEGF165)的共表达腺病毒载体Ad-Ang1-IRES-VEGF165(简称Ad-AV),为研究Ad-AV转基因细胞表达产物血管诱生活性提供实验依据。方法:采用IRES介导的Ang1和VEGF165双基因腺病毒共表达模式,通过常规的基因克隆和重组技术,构建Ad-AV双基因共表达腺病毒载体,经感染人胚肾QBI-293A细胞(293A)进行扩增和效价测定后,再感染WI-38人胚肺成纤维细胞,均用ELISA法检测VEGF、Ang1目的基因的表达,并采用鸡胚尿囊膜血管形成实验(CAM)法分析其对血管形成的影响。结果: 扩增的Ad-AV腺病毒效价可达4×10¹⁰pfu/ml;Ad-AV不仅能在293A细胞中成功表达目的基因Ang1、VEGF,而且在WI-38成纤维细胞也能成功表达,其表达产物具有显著的促进CAM上血管生成的活性。结论:成功构建并获得了Ad-Ang1-IRES-VEGF165重组病毒子, 目的基因均能在人胚肾和人胚肺成纤维细胞中表达,其表达产物具有诱导血管形成的功能。     

Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验

旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞,筛选出最佳感染剂量;Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞,RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录;MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应,Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变;RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示,100MOI为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量;Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达;Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后,能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡;Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bc...     

人IL-17F对裸鼠人肝癌移植瘤生长的影响

利用RT-PCR方法从PHA活化的人外周血单个核细胞(PBMCs)中克隆hIL-17F基因,亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1,与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60脂质体法共转染293T包装细胞,获得的成熟重组逆转录病毒(RV-hIL-17F)再感染SMMC-7721人肝癌细胞,并经G418筛选建立hIL-17F转基因肝癌细胞。PCR、RT-PCR和Westernblot结果表明hIL-17F基因在肝癌细胞中能成功整合、转录和表达。MTT和FCM结果表明hIL-17F不能改变SMMC-7721肝癌细胞的增殖活力和细胞周期,但ELISA结果表明其能明显下调肝癌细胞IL-6、IL-8和VEGF的表达。转基因肝癌细胞rhIL-17F表达上清具有抑制ECV304人脐静脉内皮细胞生长的作用。裸鼠皮下成瘤试验结果表明hIL-17F转基因肝癌细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,VEGF和CD34表达降低,血管形成显著减少。hIL-17F可通过减少肿瘤血管形成显著抑制裸鼠人肝癌移植瘤的生长,为其进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗和开发抗血管新药提供了一定的实验依据。     

腺病毒介导hIL-24抑制裸鼠肝癌荷瘤生长及其机制研究

为了研究腺病毒hIL-24抑制SMMC-7721肝癌细胞裸鼠荷瘤的生长抑制及其作用机制,构建了重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-hIL-24(Ad-hIL-24),经PacI线性化后转染QBI-293A细胞,多轮感染后收获高效价腺病毒重组病毒子。用SMMC-7721肝癌细胞使16只裸鼠致瘤,然后随机NS分成干预组、5-Fu组、Ad组和Ad-hIL-24组,进行抗肿瘤试验。四组均使用瘤体内注射干预用药,100μL/只NS组、Ad组(107pfu)和Ad-hIL-24组(107pfu)隔日一次,共注射5次;5-Fu组20μg/kg,连续注射5d。用药前、用药后1周和2周分别测皮下瘤体的长径(L)、短径(W),计算出瘤体体积,治疗开始后第15天,将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算出抑瘤率。显微镜观察细胞生长形态、免疫组化法测caspase3蛋白表达、P53及P27核内抑癌基因表达、CD34染色标记测定的MVD及VEGF蛋白表达。与NS组比较,Ad-hIL-24组与5-Fu组的抑瘤率分别为68.52%(P<0.01)和65.64%(P<0.01);镜下Ad-hIL-24组肿瘤组织的caspase3蛋白表达细胞数较其它3组呈显著性升高(P<0.01),P27核内抑癌基因表达细胞数也较NS组明显增高(P<0.01),CD34染色标记测定的CD34及VEGF较NS组和Ad组明显减少(P<0.001),P53未见明显变化。结论Ad-hIL-24可以显著抑制裸鼠SMMC-7721荷瘤的生长,其机制可能通过激活caspase途径、上调P27抑癌基因表达、抑制血管形成等多途径发挥抑瘤作用。     

家蚕在干扰素基因工程中的贡献

干扰素(IFN)是人类有核细胞内固有的干扰素基因受到外源性因子刺激时所产生的具有抗病毒,抗肿瘤和急疫调节作用的蛋白质。干扰素基因工程的研究不仅对阐明干扰素基因结构表达原理有很大的理论意义,而且对大量生产这类有防病治病价值的蛋白质具有重大的社会效益和经济效益。目前人的IFN-α.β.γ基因工程均已获得成功(如表1)。     

腺病毒载体AdING4 对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制及化疗增敏作用

目的:研究腺病毒载体AdING4对人MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制及化疗增敏作用。方法:将搭载有ING-4基因的重组腺病毒载体AdING4感染人MCF-7乳腺癌细胞,用荧光显微镜观察感染后的MCF-7细胞形态学变化;RT-PCR和Western-Blot法检测ING-4基因在MCF-7细胞中的转录和表达;RT-PCR法检测凋亡相关基因在MCF-7细胞中的表达;CCK法测定Ad-ING4感染MCF-7乳腺癌细胞后所发挥的细胞增殖抑制作用。流式细胞技术检测ING-4对MCF-7乳腺癌细胞的促凋亡作用。CCK-8法分别测定病毒感染前后的MCF-7乳腺癌细胞的药物半数抑制浓度IC50,并观察Ad-ING4与化疗药物合用后对MCF-7细胞增殖抑制和化疗增敏现象。结果:MCF-7细胞在转染ING-4基因后,明显出现变圆、脱落、皱缩、聚集等现象;外源性ING-4基因在MCF-7细胞中获得成功表达;外源性ING-4基因作用下MCF-7细胞的增殖受到了明显抑制,凋亡率有所升高,凋亡相关基因Bax的表达水平明显上调,Bcl-2、Survivin的表达水平明显下调。ING-4基因感染MCF-7细胞后,使MCF-7细胞对相关化疗药物的敏感度更高;ING-4基因与化疗药物合用后对MCF-7细胞的增殖抑制作用,较之单用化疗药物更为明显。结论:MCF-7细胞在转染ING4基因后其增殖受到了明显抑制并更易凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2及Survivin表达水平来实现的,且对化疗药物的敏感性更高。     

人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性

为了长期培养骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性,我们采用静置贴壁培养法,体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至５代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变（ＣＰＥ）法,开展了对５种病毒的敏感性试验。结果表明,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒,脊髓灰质炎病毒、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的ＣＰＥ,其效价（ＴＣＩＤ５０）可达１０＾－３～１０＾－４,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对     

中药有效成分在干扰素生物技术实验与临床研究中的应用

中草药是我国的宝贵财富,刺五加、茯苓、银耳、云芝等均具有抗菌、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤作用。而干扰素(IFN)的三种类型(α、β、γ)也具有这种生物学效应,为了研究上述补气类中药有效成分这一药理效应的物质基础和分子介质,本文用刺五加甙及其多糖,羧甲基茯苓多糖、银耳多糖、云芝糖肽等中药有效成分进行 了干扰素促诱生效应的研究。     

新的干扰素的研究进展

干扰素自被发现以来,由于其广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调控作用,受到日益关注.近年来又发现许多新的干扰素,其结构或功能与干扰素-α、β相似,但各有其特殊性,而且随着分子生物学和DNA重组技术的发展,这些新的干扰素基因均已被克隆.本文着重阐述了这些新的干扰素的生物学特性等研究进展.     

裂解型腺病毒Ad-E1A对人脐静脉内皮细胞的影响

以QBI-293A细胞基因组DNA为模板,PCR扩增E1A基因,酶切连接到pAdTrack-CMV转移质粒上,pAdTrack-CMV-E1A经PmeI线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-E1A,经PacI线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,获得裂解型腺病毒Ad-E1A。裂解型腺病毒Ad-E1A在ECV304细胞内复制裂解,抑制细胞的生长,并可以降低VEGF的表达,探讨了Ad-E1A可能通过抑制ECV304细胞NF-κB的激活而引起细胞生长抑制的机制,说明Ad-E1A具有抑制肿瘤转移的功能。