A型塞内卡病毒2C蛋白通过STING调控IFNβ、TNF-α和IL-6的表达

【背景】A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)是新发猪塞内卡病毒病的病原,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)的单股正链RNA病毒。可引起新生仔猪死亡和成年猪口、蹄部出现水泡。先天免疫是宿主抵御病毒入侵的第一道防线,但SVA与宿主抗病毒先天免疫的相互作用机制尚不清楚。【目的】探究SVA非结构蛋白2C在先天免疫应答中的作用机制。【方法】利用SVA感染和通过在猪PK-15细胞中过表达SVA2C蛋白,利用RT-qPCR和Western blotting分析2C蛋白对细胞因子表达及其关键信号通路的影响。【结果】RT-qPCR检测发现,SVA感染PK-15细胞导致IFNβ、TNF-α和IL-6表达的显著升高;同时,SVA感染导致TBK1和NF-κB的磷酸化。进一步的研究发现,SVA的2C蛋白能够激活TBK1和NF-κB磷酸化,并诱导IFNβ、TNF-α和IL-6的表达;2C蛋白能够激活抗DNA病毒感染关键蛋白干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)磷酸化,敲除STING抑...     

A型塞内卡病毒的病毒样颗粒的制备及其免疫原性分析

为了研制A型塞内卡病毒 (Senecavirus A,SVA) 的病毒样颗粒 (Virus-like particles,VLPs) 疫苗,以SVA田间流行毒株CH-FJ-2017结构蛋白基因序列为研究对象,构建了能够同时表达SVA的3种结构蛋白VP0、VP1和VP3的单个原核重组表达质粒pET28a-SVA-VP031。通过大肠杆菌Escherichia coli表达、亲和层析纯化和体外自组装,获得SVA VLPs。透射电子显微镜鉴定显示,SVA的3种结构蛋白在体外能够自组装成直径约25–30 nm的VLPs,并且动物免疫试验结果表明,该VLPs能够有效刺激豚鼠产生高水平的抗原特异性中和抗体。上述研究结果为SVA VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

A型塞尼卡病毒的分离鉴定及生物学特性研究

本文报道了对分离自湖北地区的A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)CH-HB-2017毒株进行鉴定和生物学特性研究。全基因序列分析显示,该分离株与国内毒株CH-HN-2017、CH-HNSL-2017、CH-FJ-2017和美国毒株USA-IA44952-2015、USA-IA44662-2015和USA-SD41901-2015的同源性高。该SVA可在猪肾传代细胞(IBRS-2)和猪睾丸细胞(Swine testis cells,ST)中复制增殖,感染后都能产生CPE,通过病毒一步生长曲线、蚀斑试验和定量PCR等试验表明,该毒株对IBRS-2细胞更易感,病毒滴度更高。本实验成功分离到1株SVA流行毒株,并研究了该毒株的生物学特性,为深入研究该病毒奠定基础。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究

本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平（P<0.01）;同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高（P<0.01）。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。     

PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(T_m);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。     

CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响

【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9）技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T）细胞系,为开展宿主泛素特异性蛋白酶30（ubiquitin-specific protease 30,USP30）蛋白的功能研究建立了细胞模型;同时,初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段,设计并合成2对引导RNA （single guide RNAs,sgRNA）,分别构建在pX459载体中;将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞,并用嘌呤霉素处理,筛选出转染阳性的细胞,然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现,SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系,首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用,为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型,也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。     

主要禽源病毒相关microRNA的研究进展

近年来,禽类病毒性疾病已经成为研究病毒感染和致病机制的重要模型之一,而且病毒与micro RNA的调控关系和机制研究也成为人们关注的焦点。本文简要总结禽源疱疹病毒编码micro RNA的概况,以及禽源疱疹病毒的致瘤性与micro RNA的表达调控关系,同时探讨了利用micro RNA靶向调控机制在病毒疾病(如传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽流感病毒等)防治中的可能应用。     

人巨细胞病毒潜伏感染机制的研究进展

人巨细胞病毒可通过原发感染或者潜伏感染再激活而广泛传播.基于对人巨细胞病毒AD169株和Towne株基因测序的完成,以及人巨细胞病毒的基因功能研究及其相关动物模型如小鼠模型、猪模型、恒河猴模型等的研究,人巨细胞病毒感染的潜伏机制研究取得了一定进展.本文从人巨细胞病毒的感染机制、免疫应答和免疫逃避三方面对人巨细胞病毒潜伏感染机制的研究现状进行简要综述.     

小鼠精囊自身抗原的原核表达和纯化

目的：在原核细胞中表达小鼠精囊自身抗原（SVA）,并对表达产物进行鉴定和纯化。方法：提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR获得SVA的cDNA,设计并合成特异引物序列,进一步扩增出不含信号肽的SVA编码序列,连入原核表达载体pET28a中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达,Western印迹分析表达产物His-SVA,采用Ni-NTA纯化融合蛋白His-SVA。结果：原核表达获得融合6个组氨酸的SVA,用抗His单克隆抗体进行Western印迹鉴定,检测到相对分子质量约18×10^3的目的蛋白,与理论值一致;经Ni-NTA纯化获得较高纯度的His-SVA融合蛋白。结论：获得了在大肠杆菌中表达的小鼠附睾蛋白SVA,为后续研究其对小鼠生殖的影响奠定了基础。