实蝇类害虫分子鉴定研究进展

随着国际贸易活动的日趋频繁及其复杂化,实蝇类害虫的传播扩散机率越来越大,直接威胁农业生产安全,成为影响果蔬等进出口贸易的重要检疫问题之一。因此,实蝇的准确识别与快速鉴定受到了世界各国的高度重视。本文主要对目前已经被用于实蝇鉴定的分子生物学技术的原理、优缺点及其研究进展进行概述;同时,根据BOLD Systems现有的数据,汇总了截至2014年10月22日实蝇DNA条形码的种类、已公布研究的记录数及涉及的实蝇种类。结果表明:目前应用于实蝇鉴定的DNA条形码有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7种;其中以COⅠ标记为主,已公布的记录数为4540,是其他5种DNA标记的113.5倍,COⅠ-5P标记研究的实蝇科种类有315种,COⅠ-3P标记的有116种;目前研究较多的为果实蝇属、寡鬃实蝇属、腊实蝇属。本文对今后选用分子生物学技术鉴定实蝇种属具有重要的理论意义。     

云南边境地区果实蝇属种类DNA条形码鉴定

【目的】果实蝇属Bactrocera中有国际上重要的检疫性害虫, 基于形态的物种鉴定有一定的局限性。另一方面, 云南边境地区为东南亚地区实蝇入侵我国的重要通道。因此, 对该地区实蝇分子鉴定方法的研究对于该属物种的快速准确鉴定具有重要意义。本研究旨在探讨DNA条形码技术在果实蝇属物种鉴定中的有效性。【方法】使用线粒体基因COI和COII序列的通用引物对果实蝇属20个物种60份样品进行PCR扩增、测序和序列分析; 采取距离方法和建树方法评价2种序列的鉴别能力。【结果】COI和COII序列平均长度分别为682 bp和339 bp, 种内和种间遗传差异较大, 有较明显的遗传距离间隔（barcoding gap）, 鉴定成功率分别为91.2%和90.7%。另外, 分子系统树表明华实蝇亚属Sinodacus不是单系群。【结论】COI和COII序列均能够将绝大多数果实蝇属物种进行准确鉴别, 应用COI或COII序列进行果实蝇属物种鉴定具有一定的可行性。     

基于DNA条形码的四川老君山国家级自然保护区尺蛾科昆虫种类鉴定

为了解四川老君山国家级自然保护区鳞翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae资源,于2019年6—8月和2020年5—6月通过灯诱法采集2 402号标本,运用DNA条形码技术对标本进行分子鉴定。通过BOLD数据库,邻接法构建系统发育树和ABGD在线工具对获得的297条线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列进行物种界定,结合BOLD和GenBank中70条相关种序列共367条COⅠ基因序列分析遗传距离。发现297条序列隶属于191种,其中95种鉴定到种,35种鉴定到属;鉴定到属或种水平的序列隶属于92属。计算遗传距离发现,种内遗传距离为0～4.36%,平均种内遗传距离为0.63%,种间遗传距离为3.43%～19.12%,平均种间遗传距离为11.91%。结果表明,保护区尺蛾科昆虫种类丰富,基于COⅠ基因的DNA条形码技术能有效区分尺蛾科物种。     

基于DNA条形码对桃属植物上蚜虫的快速鉴定

桃属(Amygdalus)植物是我国重要的果树,有些种类是常见的城市绿化观赏树种,也是多种蚜虫的寄主。蚜虫的体型小,有复杂的多型现象,传统的形态学特征往往无法实现对物种的准确而快速的鉴定。本研究应用DNA条形码技术,基于COⅠ基因序列分析,对我国桃属植物上的蚜虫进行编码,为桃属植物上蚜虫的物种快速、准确鉴定提供有力的支持。本研究共编码桃属植物上蚜虫12种,其中蚜亚科Aphidinae 6属10种,毛管蚜亚科Greenideinae 1属1种,毛蚜亚科Chaitophorinae 1属1种。共获得COⅠ基因序列96条,种内平均差异为0.76%,种间为5.7%¹5.5%。基于COⅠ序列构建了NJ树,绝大多数物种的样品有效地聚为一支,且支持率达到了95%以上。结合遗传距离和系统发育树分析表明,基于COⅠ序列的DNA条形码能有效区分99%的桃属植物上的蚜虫物种。     

我国32种鸟类DNA条形码分析

DNA条形码是一种分子分类方法,近年来在物种鉴定方面得到迅速的发展和应用.本研究分析了我国27属32种鸟类(61只)的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的条形码片段,分别用阈值法、聚类法和诊断核苷酸进行了分析,探究DNA条形码鉴定我国鸟类的准确性.结果显示,种内CO Ⅰ序列变异很小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离,DNA条形码序列能够鉴定所有鸟类.     

基于COI序列快速鉴定花蓟马的DNA条形码芯片初探

利用DNA条形码信息研制DNA芯片,建立快速高效的花蓟马鉴定方法.以3种花蓟马属,共9个样本的COⅠ基因片段序列为研究材料,应用软件Primer Premier5搜索出9个样本的12种motif基因序列,应用这12种motif序列制作虚拟DNA条形码芯片.虚拟电子杂交20个样本的COⅠ基因片段序列.结果显示,设计的虚拟DNA芯片能够鉴定本研究中的3种花蓟马,利用DNACOⅠ基因片段,设计DNA芯片在理论上可行.     

五种常见嗜尸性蝇类的分子鉴定

为了解决法医学人员对于嗜尸性蝇类的鉴定难题,对中山市、广州市及西安市5种常见嗜尸性蝇类共17个样本,对其线粒体COⅠ基因的348 bp大小片段进行了RFLP和DNA序列分析,采用ABI377测序仪测序,DNASTAR软件预测限制性位点,DdeⅠ, DraⅠ和HinfⅠ3种限制性内切酶消化,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果,MEGA3.0软件包进行序列分析和构建系统发育树。结果表明： 采用mtDNA扩增结合银染技术和DNA序列分析,均可以方便快捷地进行上述三地5种常见嗜尸性蝇类的种类鉴定。本文结果为法医昆虫学中嗜尸性昆虫DNA鉴定数据库的建立提供了数据资料。     

猫科动物DNA条形码及线粒体假基因对物种鉴定的影响

在多种动物类群中,基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的DNA条形码是一种高效的物种鉴别手段,然而猫科Felidae动物中广泛存在的线粒体假基因可能影响DNA条形码的有效性。本研究共涉及猫科动物12属25种119个样本。采用3对条形码通用引物对6属11种29个猫科动物样本进行了扩增及测序。结果3个样本扩增失败,8个样本得到假基因,18个样本获得了条形码序列。结合另外93条猫科动物条形码序列(源自BOLD Systems),采用Kimura 2-parameter模型计算遗传距离,构建Neighbor-Joining(NJ)树。结果显示,遗传距离种内为0%~8.1%,平均0.8%;种间为1.4%~13.1%,平均8.7%;属间为8.2%~21.8%,平均15.1%。NJ树显示,除3个种外,其余物种均以极高的置信度(99%)形成单系分支。而假基因序列有些可以单独形成分支,有些夹杂在COⅠ序列形成的分支中,对物种鉴定产生干扰。     

印度-西太平洋胡椒鲷亚科鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

为探讨COⅠ基因作为条形码在胡椒鲷亚科鱼类物种鉴定的可行性, 研究测定了胡椒鲷亚科8种鱼类51个个体线粒体COⅠ基因长度为651 bp的序列, 利用MEGA 5.0计算胡椒鲷亚科种内与种间的遗传距离, 基于最大似然法与贝叶斯法构建了系统进化树。结果显示: 胡椒鲷亚科鱼类种间平均遗传距离(0.142)显著大于种内平均遗传距离(0.003), 物种间遗传距离均大于Hebert推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.020(2%)。系统进化树上, 同一物种不同个体间均能形成独立的单系分支, 表明COⅠ基因可作为胡椒鲷亚科物种鉴定的有效条形码基因。研究同时揭示, 在形态分类上被认为是同种异名的两种胡椒鲷(条纹胡椒鲷与东方胡椒鲷)的COⅠ基因序列差异达到0.070, 有可能是两个独立的物种。此外, 在属级水平, 少棘胡椒鲷属与胡椒鲷属种类之间的平均遗传距离小于胡椒鲷属内部种间的遗传距离, 支持少棘胡椒鲷归属于胡椒鲷属的观点。       

应用DNA条形码技术对蚤蝇科性二型鉴别

蚤蝇科昆虫种类众多,其幼虫食性分化明显,具典型的性二型现象,面临物种鉴定与系统发育重建两大难题。依靠网络技术发展起来的DNA分类,特别是基于单一短片度的DNA条形码技术的快速发展和应用给解决蚤蝇难题带来了新的契机和突破点。本文针对4种实验室长期饲养的尸食性蚤蝇:蛆症异蚤蝇Megaselia scalaris(Loew),东亚异蚤蝇Megaselia spiracularis Schmitz,广东栅蚤蝇Diplonevra peregrina(Wiedemann)和角喙栓蚤蝇Dohrniphora cornuta(Bigot),应用676 bp COⅠ基因序列对性二型蚤蝇进行雌雄配对,验证了DNA条形码在解决性二型配对难题方面的有效性,同时为蚤蝇系统分类学、生物防治、口岸检疫以及法医鉴定等领域提供相应技术支持。     

桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用

实蝇类害虫多为国内外检疫对象, 其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征, 而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体, 则无能为力。本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体（卵、 幼虫、 蛹）以及成虫残体（足、 翅、 头部、 胸部、 腹部）为对象, 利用 DNA 条形码技术, 构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系, 并以其他4种常见实蝇（包括番石榴实蝇B. correcta、 瓜实蝇B. cucurbitae、 南亚果实蝇B. tau、 柑桔大实蝇B. minax）为对象对该技术体系进行应用验证。结果显示, 桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种COⅠ基因碱基序列的一致性为99.51%~99.84%, 其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种COⅠ基因序列的一致性分别为100%, 100%, 99.81%~99.83%和100%; 以邻接法（NJ法）构建系统发育树, 靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支, 且置信度均为100%。以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出, 5种实蝇的种间遗传距离为0.0597~0.2363, 平均为0.1693; 种内遗传距离为0.0000~0.0041, 平均为0.0019。这些结果表明, 基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。     

基于线粒体COⅠ基因的沙鳅亚科鱼类DNA条形码及其分子系统发育研究

选择线粒体COⅠ基因作为分子标记,进行沙鳅亚科鱼类（Botiinae）DNA条形码及其分子系统发育研究。研究获得了沙鳅亚科7属19种共131个个体的COⅠ基因序列,利用MEGA5.0软件分析了沙鳅亚科鱼类COⅠ基因的序列特征,计算了种内及种间遗传距离。沙鳅亚科鱼类的分子系统发育关系的重建分别采用NJ法和Bayesian法。研究发现,沙鳅亚科COⅠ基因的碱基组成为: A 24.4%、T 29.5%、G 18.0%、C 28.1%。沙鳅亚科鱼类种内平均遗传距离为0.0020.000,种间平均遗传距离为0.1480.008。DNA条形码研究结果显示,所分析的19种沙鳅鱼类各自分别聚成单系分支,表明COⅠ基因在本研究中具有100%的物种鉴别率。同时,系统发育分析支持各属的单系性,并且结果显示沙鳅亚科鱼类聚为两个分支,其中一支由薄鳅属和副沙鳅属构成,另一分支则包括: （沙鳅属、色鳅属）和 中华沙鳅属、（缨须鳅属、安彦鳅属）。因此,COⅠ基因可以作为有效的分子标记对沙鳅亚科进行DNA条形码研究以及分子系统发育研究。       

基于线粒体COⅠ基因的齿小蠹属昆虫DNA条形码研究

齿小蠹属（鞘翅目： 小蠹科）昆虫是植物检疫中经常截获的类群, 为探讨线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特定区段作为DNA条形码快速准确鉴定齿小蠹种类的可行性, 以齿小蠹属昆虫为研究对象, 测定分析了线粒体COⅠ基因462 bp碱基序列。序列分析结果显示： 变异位点为259个, 保守位点203个, 简约信息位点181个, 自裔位点78个。所有位点中, A, G, C和T碱基平均含量分别为30.7%, 16.5%, 17.0%和35.8%。A+T含量较高, 为66.5%, 明显高于G+C含量, 表现明显的A+T碱基偏嗜, 且A与T含量相当, 符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。转换与颠换结果显示： 该段序列未达到饱和, 可以得到准确的进化分析。利用Kimura 2-parameter模型分析遗传距离得到, 同物种间的遗传距离介于0.002~0.007之间, 不同种间的遗传距离介于0.056~0.431间, 平均遗传距离为0.199, 说明该段序列能够区分不同物种。基于COⅠ基因序列构建的邻接法系统发育树（NJ树）显示, 同一物种聚为同一小支, 且分支自展值均为100%; 近缘种能聚集在一起, 且置信度很高（≥97%）。结果表明应用基于COⅠ基因片段的DNA条形码进行齿小蠹属昆虫分类鉴定具有可行性。     

DNA条形码技术在田间常见蓟马种类识别中的应用

蓟马类害虫种类多、 体型小, 传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。本研究利用DNA条形码通用型引物, 以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ gene, mtDNA COⅠ) 基因 (约650 bp), 通过对靶标片段碱基序列的测序及比对分析, 以邻接法 (NJ法) 构建系统发育树, 并以Kimura双参数模型计算种内、 种间遗传距离。结果表明： 聚类分析与形态学鉴定结果一致, 表现为较长的种间分支和较短的种内分支, 每个单系分支对应一个物种, 同一物种不同单倍型的最初分支自展值均为100%。25种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027, 种间平均遗传距离为0.2757, 种间遗传距离为种内遗传距离的102.1倍; 而且种内、 种间遗传距离没有重叠区域。结果说明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别。     

基于mtDNA COI基因的离腹寡毛实蝇属常见种DNA条形码识别和系统发育分析

【目的】离腹寡毛实蝇属Bactrocera昆虫是最具经济重要性的实蝇类害虫,本研究依据mtDNA COI基因碱基序列对离腹寡毛实蝇属常见实蝇种类进行识别鉴定与系统发育分析。【方法】以口岸经常截获的离腹寡毛实蝇属8个亚属21种实蝇为对象,采用DNA条形码技术,通过对mtDNA COI基因片段 (约650 bp)的测序和比对,以MEGA软件的K2-P双参数模型计算种内及种间遗传距离,以邻接法(NJ) 构建系统发育树。【结果】聚类分析与形态学鉴定结果一致,除11种单一序列实蝇外,其他10种实蝇均各自形成一个单系,节点支持率为99%以上。种内（10种）遗传距离为0.0003~0.0068,平均为0.0043;种间（21种）遗传距离为0.0154~0.2395,平均为0.1540;种间遗传距离为种内遗传距离的35.8倍,而且种内、种间遗传距离没有重叠区域。【结论】基于mtDNA COI基因的DNA条形码技术可以用于离腹寡毛实蝇属昆虫的快速鉴定识别,该技术体系的建立对实蝇类害虫的检测监测具有重要意义。     

地中海实蝇幼虫分子鉴定

通过对从秘鲁进口的葡萄中截获实蝇类幼虫进行ITS区和线粒体COⅠ,COⅡ,COⅢ、ND5基因序列的扩增和测序,并与GenBank中对应的序列进行比对,结果表明,截获样品ITS区序列和地中海实蝇Ceratitis capitata(Wiedemann)同源性为95·16%(其中ITS1为99·52%,ITS2为86·2%),线粒体COⅠ,COⅡ,COⅢ,ND5基因序列和地中海实蝇C.capitata同源性为100%,99·9%,99·5%,99·8%;基于COⅠ序列构建的系统发育树中,幼虫样品和地中海实蝇最为接近。根据序列分析和系统发育关系分析的结果,将截获的实蝇类幼虫鉴定为地中海实蝇C.capitata。     

基于线粒体CO 1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用

本研究探讨了线粒体CO1基因作为DNA条形码对鲌属鱼类进行物种鉴定的可行性。研究中获得了鲌属4种鱼类共32个个体长度为816bp的CO1基因序列。利用MEGA软件计算鲌属鱼类种间及种内遗传距离,利用邻接法、最大简约法、最大似然法和Bayesian方法分别构建分子系统树。结果显示,鲌属鱼类的种间遗传距离显著大于种内遗传距离。在系统树中,鲌属鱼类每一物种的个体分别形成各自独立的分支。基于CO1基因的DNA条形码在识别鲌属鱼类物种方面和传统形态学基本一致,而且该基因可以探讨鲌属鱼类种间的系统发育关系。本研究表明以CO1基因作为鲌属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。     

浙江近海鰓属鱼类形态描述及中国鰓属鱼类分子系统发育分析

为明确浙江近海鲵属鱼类物种组成, 对采自舟山和温州近海共计411尾鲵鱼样品进行形态学测定, 并基于线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因片段探讨其序列差异及系统发育关系。结果显示: 浙江近海的鲵属鱼类为少鳞鲵和中国鲵, 两种鲵鱼形态特征鲜明, 鱼鳔形态差异明显。所测得的少鳞鲵和中国鲵COⅠ基因片段长度均为600 bp, 平均GC含量分别为46.6%和49.9%。依据Kimura-2-parameter模型(K2P), 少鳞鲵和中国鲵的种内平均遗传距离分别为0.002和0.000, 两种间平均遗传距离为0.211。采用邻接法构建的系统发育树显示, 中国鲵先和邵氏鲵聚为一支, 然后与少鳞鲵聚为一支, 再与其他鲵属鱼类聚类。研究结果明确了浙江沿海鲵属鱼类的物种组成, 并为探讨少鳞鲵和中国鲵的系统发育关系及基于COⅠ基因的鲵属鱼类物种鉴定提供了参考。