线粒体COI基因在少鳞鳜属(Coreoperca)鱼类条形码区段的变异分析

为了研究线粒体COI基因作为DNA条形码对少鳞鳜属(Coreoperca)鱼类进行物种鉴定的可行性.采用PCR扩增与测序技术与GenBank已有序列联合分析的方法,对少鳞鳜属3种84个个体的条形码区段进行比较分析.结果表明,碱基T(U)的平均含量为30.3％,C的平均含量为27.8％,A的含量为23.1％,G的含量为18.8％.在4种碱基中,G的含量最低,其在第三密码子的使用率上也低至9.3％.少鳞鳜属3种鱼类种内平均遗传距离值为0.003 8,种间为0.146 3,种间遗传距离是种内的38倍;通过构建的系统发育树,少鳞鳜属中的分支明确,种间无交叉情况,说明种间具有明显差异,种内没有亚种的分化.研究证明,线粒体COI基因可作为条形码序列对少鳞鳜属鱼类物种鉴别的有效片段,并且还为其物种的鉴定与分类提供辅助方法.     

基于线粒体COⅠ基因的沙鳅亚科鱼类DNA条形码及其分子系统发育研究

选择线粒体COⅠ基因作为分子标记,进行沙鳅亚科鱼类（Botiinae）DNA条形码及其分子系统发育研究。研究获得了沙鳅亚科7属19种共131个个体的COⅠ基因序列,利用MEGA5.0软件分析了沙鳅亚科鱼类COⅠ基因的序列特征,计算了种内及种间遗传距离。沙鳅亚科鱼类的分子系统发育关系的重建分别采用NJ法和Bayesian法。研究发现,沙鳅亚科COⅠ基因的碱基组成为: A 24.4%、T 29.5%、G 18.0%、C 28.1%。沙鳅亚科鱼类种内平均遗传距离为0.0020.000,种间平均遗传距离为0.1480.008。DNA条形码研究结果显示,所分析的19种沙鳅鱼类各自分别聚成单系分支,表明COⅠ基因在本研究中具有100%的物种鉴别率。同时,系统发育分析支持各属的单系性,并且结果显示沙鳅亚科鱼类聚为两个分支,其中一支由薄鳅属和副沙鳅属构成,另一分支则包括: （沙鳅属、色鳅属）和 中华沙鳅属、（缨须鳅属、安彦鳅属）。因此,COⅠ基因可以作为有效的分子标记对沙鳅亚科进行DNA条形码研究以及分子系统发育研究。       

基于线粒体COⅠ基因部分序列的长江口舌鳎科鱼类系统分类研究

为了确定线粒体COⅠ基因在长江口舌鳎科鱼类系统分类及物种鉴定中的作用,本实验采用线粒体COⅠ基因特异扩增测序及GenBank已有序列联合配对分析的方法,对长江口舌鳎科2属9种鱼类39个COⅠ基因片段的序列进行比较和系统进化研究。采用MEGA 5.0软件进行统计分析,舌鳎科鱼类该片段的平均AT含量高于GC含量,第1密码子位点含量最高(51.8%～57.3%,平均53.8%),第2密码子的含量稳定,均为42.0%,第3密码子变化范围最大(28.1%～37.8%,平均32.4%)。依据Kimura-2-parameter模型,9种舌鳎科鱼类种间遗传距离平均值为0.191,种内为0.003,种间遗传距离是种内的63.7倍。采用最大简约法(MP) 和邻接法(NJ)构建系统发育树,显示长江口舌鳎科鱼类为明显的单系群,但舌鳎科鱼类内部的系统发育关系与形态分类划分的亚属并不完全一致,其中须鳎属的日本须鳎(Paraplagusis japonica)与拟舌鳎亚属的宽体舌鳎(Cynoglossus robustus)聚为一支。虽然三线舌鳎亚属的种类均可聚为独立的分支,但短吻三线舌鳎(C. abbreviatus)与紫斑舌鳎(C. purpureomaculatus)、长吻红舌鳎(C. lighti)与短吻红舌鳎(C. joyneri),两组间种间遗传距离分别为0.002和0.007,两组物种间均存在同种异名现象。本研究表明,线粒体COⅠ基因作为分子标记除了能筛选出同种异名种类外,还能够对舌鳎科鱼类进行有效的物种鉴定和系统进化分析,线粒体COⅠ基因作为分类条形码是可行的。     

中国布氏鲾属鱼类的分类探讨

研究旨在利用传统形态学与DNA条形码技术相结合的方法, 进一步探讨中国布氏鲾属Eubleekeria Fowler 1904鱼类的分类与鉴定问题。2014—2016年从广东湛江和广西北海、防城港和东兴近海采集了153尾鲾科鱼类样品, 经形态学鉴定为布氏鲾属种类: 琼斯氏布氏鲾Eubleekeria jonesi (James, 1971)。该种主要鉴别特征为: 眼位于口裂的水平线之上, 颊部无鳞, 两臀鳍之间区域裸露无鳞, 颈部有半圆形裸露无鳞区域, 背鳍上黑斑色淡, 略呈灰色。将其鉴别特征与相关文献记录比较, 表明之前中国大陆记录的黑边布氏鲾Eubleekeria splendens (Cuvier, 1829)可能为琼斯氏布氏鲾。基于线粒体COⅠ基因片段结合GenBank中布氏鲾属鱼类的同源序列, 采用邻接法构建的分子系统树显示, 此研究中采集自中国大陆的布氏鲾属鱼类标本与中国台湾记录的黑边布氏鲾Eubleekeria splendens (Cuvier, 1829)明显地分为两支。基于Kimura双参数模型(K2P)计算, 支系间遗传距离为0.130, 远大于支系内平均遗传距离(0.005和0.006), 支持将二者作为独立物种的观点, 与此研究传统形态学方法的结果一致。     

西太平洋沿海石斑鱼属鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

研究测定了分布于西太平洋沿海的35种石斑鱼属鱼类共142个个体线粒体基因COⅠ及核基因TMO-4C4标记序列, 基于最大似然法与贝叶斯法构建分析了石斑鱼类分子系统进化关系。同时, 探讨了COⅠ基因作为DNA条形码在石斑鱼属鱼类物种鉴定中的有效性问题。结果显示: 35种石斑鱼属鱼类COⅠ同源序列为636 bp, 编码212个氨基酸, TMO-4C4同源序列为486 bp, 编码162个氨基酸, 在COⅠ基因中, 种间遗传距离在0.030—0.202, 平均遗传距离为0.143, 物种间遗传距离均大于Hebert 推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.020(2%)。种内遗传距离0.000—0.008, 平均遗传距离为0.003, 种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的48倍, 显著大于种内平均遗传距离, 表明COⅠ基因可作为石斑鱼属物种鉴定的有效条形码基因。基于COⅠ及TMO-4C4构建的系统进化树上, 35种石斑鱼主要形成2个主要类群, 类群Ⅰ由细点石斑鱼(Epinephelus cyanopodus)和蓝棕石斑鱼(Epinephelus multinotatus)等22种石斑鱼聚成, 类群Ⅱ由吊桥石斑鱼(Epinephelus morrhua)和小点石斑鱼(Epinephelus epistictus)等13种石斑鱼组成。部分存在同种异名争议的种类如云纹石斑鱼(Epinephelus moara)/褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)/马拉巴石斑鱼(Epinephelus malabaricus)经COⅠ及TMO-4C4序列差异及进化分析, 均存在较大的遗传分化。结果支持近期的分类研究, 云纹石斑鱼/褐石斑鱼和斜带石斑鱼/马拉巴石斑鱼均为独立的物种, 并非同种异名的分类。     

印度-西太平洋胡椒鲷亚科鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

为探讨COⅠ基因作为条形码在胡椒鲷亚科鱼类物种鉴定的可行性, 研究测定了胡椒鲷亚科8种鱼类51个个体线粒体COⅠ基因长度为651 bp的序列, 利用MEGA 5.0计算胡椒鲷亚科种内与种间的遗传距离, 基于最大似然法与贝叶斯法构建了系统进化树。结果显示: 胡椒鲷亚科鱼类种间平均遗传距离(0.142)显著大于种内平均遗传距离(0.003), 物种间遗传距离均大于Hebert推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.020(2%)。系统进化树上, 同一物种不同个体间均能形成独立的单系分支, 表明COⅠ基因可作为胡椒鲷亚科物种鉴定的有效条形码基因。研究同时揭示, 在形态分类上被认为是同种异名的两种胡椒鲷(条纹胡椒鲷与东方胡椒鲷)的COⅠ基因序列差异达到0.070, 有可能是两个独立的物种。此外, 在属级水平, 少棘胡椒鲷属与胡椒鲷属种类之间的平均遗传距离小于胡椒鲷属内部种间的遗传距离, 支持少棘胡椒鲷归属于胡椒鲷属的观点。       

基于线粒体CO 1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用

本研究探讨了线粒体CO1基因作为DNA条形码对鲌属鱼类进行物种鉴定的可行性。研究中获得了鲌属4种鱼类共32个个体长度为816bp的CO1基因序列。利用MEGA软件计算鲌属鱼类种间及种内遗传距离,利用邻接法、最大简约法、最大似然法和Bayesian方法分别构建分子系统树。结果显示,鲌属鱼类的种间遗传距离显著大于种内遗传距离。在系统树中,鲌属鱼类每一物种的个体分别形成各自独立的分支。基于CO1基因的DNA条形码在识别鲌属鱼类物种方面和传统形态学基本一致,而且该基因可以探讨鲌属鱼类种间的系统发育关系。本研究表明以CO1基因作为鲌属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。     

中国泥鳅属和副泥鳅属鱼类的分类整理

根据形态学特征及线粒体Cyt b和COⅠ基因对我国泥鳅属(Misgurnus)和副泥鳅属(Paramisgurnus)鱼类进行了分类整理。结果表明: 泥鳅属和副泥鳅属鱼类在鳞焦大小, 须长及基枕骨末端愈合程度等特征上存在差异。基于联合基因分析, 泥鳅属和副泥鳅属属间遗传距离(15.2%—17.5%)接近于泥鳅属种间遗传距离(10.7%—18.4%); 分子系统树显示我国泥鳅属鱼类未构成单系, 副泥鳅属嵌套分布于泥鳅属中; 北方泥鳅(Misgurnus bipartitus)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)亲缘关系近, 其次是大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus), 黑龙江泥鳅(Misgurnus mohoity)位于系统树的基部。结合形态特征与分子数据, 副泥鳅属应作为泥鳅属同属异名, 大鳞副泥鳅应归入泥鳅属; 北方泥鳅曾为黑龙江泥鳅的同物异名, 与黑龙江泥鳅存在明显的形态差异, 且两者亲缘关系较泥鳅远, 北方泥鳅为有效种。     

基于线粒体COⅠ基因片段的麻蝇属(双翅目:麻蝇科)部分种类DNA分类研究

本研究在Pape(1996)提出的麻蝇属(双翅目:麻蝇科)分类系统基础上,选取麻蝇属54个物种(分属于30个亚属),基于线粒体COⅠ基因片段,结合雄性成蝇尾器形态特征,对所选取的30个亚属进行了DNA分类研究,初步探明了各亚属的分类地位与系统发育关系。麻蝇属30个亚属内的平均遗传距离为6.0%(1.8%¹1.0%),各亚属间的平均遗传距离为10.1%(5.2%11.0%),各亚属间的平均遗传距离为10.1%(5.2%¹6.1%),亚属内与亚属间遗传距离差异较为明显,说明COⅠ基因片段对麻蝇属各亚属级阶元能进行有效区分。     

基于CO Ⅰ基因的龟鳖目动物鉴定与分类进化分析

为探索COⅠ基因条形码技术在龟鳖目物种分类与鉴定中的适用性,本研究应用通用引物PCR扩增获得龟鳖目动物9科26属45种共205个样品的634 bp COⅠ基因序列片段进行研究分析。结果显示,COⅠ基因在龟鳖目动物中存在少量的碱基插入和缺失,共计12种20个位点,物种占比34.28%;平均碱基含量(A+T)为55.42%,显著高于(G+C)的44.58%。通过Kimura's 2-parameter计算45个物种的种内遗传距离为0～0.023 98,平均为0.003 2;种间遗传距离为0.022 3～0.334 9,平均为0.1 637,种间平均遗传距离约为种内平均遗传距离的51.16倍;有3个物种的种内遗传距离大于Hebert推荐区分物种的最小种间遗传距离0. 02,其中1个物种的种内遗传距离大于45个物种的种间最小遗传距离0.022 3。同科内不同属间及同目内不同科间的遗传距离分别为0.146 7、0.212 7,显示物种间遗传距离随着分类阶元的上升而逐步扩大。系统进化树聚类结果显示,不同个体依据亲缘关系程度不同分别聚为独立的一支,没有出现物种交叉分布,能准确反映个体间的亲缘关系。结果表明利用COⅠ基因鉴定龟鳖目物种具有可行性,但科内属间及以上分类阶元进化节点自展率不高,无法通过COⅠ基因明确其进化关系,须结合其他DNA指标加以确认。     

多鳞fih-1基因克隆及其低氧胁迫的mRNA表达

为研究多鳞(Sillago sihama)低氧诱导因子抑制因子-1(factor inhibiting hypoxia inducible factor 1, fih-1)在低氧胁迫后的表达机制, 实验通过PCR扩增技术克隆出多鳞fih-1基因cDNA全长1280 bp, 开放阅读框(ORF)1065 bp, 编码353个氨基酸, 具有JmjC保守结构域。多序列比对与聚类分析显示, 多鳞与大黄鱼和尖吻鲈的亲缘关系最近, 与哺乳动物、两栖类和禽类的亲缘关系较远。fih-1基因mRNA在多鳞多个组织中有不同表达, 在精巢、卵巢和肌肉中的表达水平最高, 在鳃、心脏和肝脏组织表达水平较高, 在脑组织的表达水平较低。实时荧光定量PCR分析fih-1基因在低氧胁迫处理前后鳃和心脏组织中mRNA的表达情况, 结果显示fih-1基因在两个组织均随低氧胁迫处理时间延长表达量显著升高 (P< 0.05)。研究表明fih-1基因在多鳞低氧信号传导通路中扮演重要角色, 为开展并解释多鳞低氧胁迫遗传机制提供候选基因。     

青海湖裸鲤舌状绦虫裂头蚴的分子鉴定及系统发育研究

通过PCR方法扩增了青海湖裸鲤体腔寄生舌状绦虫18S rRNA、COⅠ和COB基因部分序列, 并进行分子鉴定, 分析了3种基因的同源性, 利用这3种基因进行分子进化和系统发育研究。结果显示, 经过分子鉴定, “面条样”绦虫为肠舌状绦虫, 克隆的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列分别与AF254121(中国)、AF153910(中国)和JQ279109(阿尔及利亚)的核苷酸序列同源性为100.00%、99.49%和93.32%。同时, 利用GenBank中其他种属绦虫的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列构建系统发育树, 均与已鉴定的肠舌状绦虫聚在同一支上, 且与肠舌状绦虫中国广州分离株种属亲缘关系较近, 与其他绦虫所属分支相距较远。初步阐明了鉴定的肠舌状绦虫分离株与其他种属之间的系统发育关系。     

浙江近海春、夏季蟹类群落结构及其与环境因子的关系

根据2015年4月和7月浙江近岸海域单船底拖网调查资料, 分析了春、夏两个季节浙江近岸海域蟹类的种类组成、优势种及资源密度分布, 采用生态多样性指数和丰度/生物量比较曲线(ABC曲线)分析了群落物种多样性及其动态变化, 同时运用典范对应分析(CCA)研究了蟹类群落变化与海洋环境因子的关系。结果表明: 浙江沿岸海域春、夏季共捕获蟹类28种, 隶属于11科19属, 调查海域蟹类主要以暖水性种类占优势; 春季优势种为双斑蟳(Charybdis bimaculata)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和日本蟳(Charybdis japonica), 夏季优势种为三疣梭子蟹和双斑蟳; 两个季节蟹类平均资源密度分别为244.38 和585.60 kg/km2, 中北部海域资源密度高于南部海域; 种类丰富度指数(D)、物种多样性指数(H′)和种类均匀度指数(J′)三种群落多样性指数均不高, 蟹类群落多样性水平处于较低水平; 根据ABC曲线评估干扰对蟹类群落的影响可得: 春、夏季浙江近岸蟹类群落分别处于严重干扰和中等干扰状态; 典范对应分析结果表明: 在进行对应分析的9个环境因子中, 水深为影响研究海域春夏两季蟹类分布的首要环境因子; 盐度(表层和底层)为影响蟹类分布的次要环境因子, 其他环境因子也均在一定程度上影响蟹类群落分布。     

基于线粒体COⅠ和16S rRNA基因序列比较分析东海带鱼群体遗传多样性

测定了东海带鱼(Trichiurus lepturus Linnaeus)三个群体(命名为A: 122°32′E 29°55′N、B: 123°30′E 26°75N; C: 124°24′E 27°26′N)72个个体的线粒体DNA16S rRNA和COⅠ基因序列,通过单基因序列和联合序列分析, 研究了东海带鱼群体的遗传变异情况。分别得到1130 bp的COⅠ基因序列片段和554 bp的16S rRNA序列片段, 其中COⅠ基因片段的T、C、A、G含量分别为29.0%、28.9%、24.4%和17.7%; 16S rRNA基因片段的T、C、A、G含量分别为22.7%、27.6%、28.0%和21.7%。基于线粒体16S rRNA、COⅠ和16S+COⅠ基因序列分析, 72个个体中分别确定43个, 8个和49个单倍型, 存在单倍型共享现象。群体的单倍型多样性指数为0.9766—0.9992, 显示了群体内的单倍型较为丰富。3个群体间各序列平均核苷酸差异数(K)在5.111—9.024和0.0045—0.0076, 核苷酸多样性指数(π)为0.0048—0.0084, 显示不同带鱼群体遗传多态性丰富。使用邻接法构建的分子进化树揭示同一群体内大部分个体聚在一起。分析结果表明, 群体A遗传背景比群体B、群体C较为丰富, 群体内部个体差异大于群体间差异, 群体间基因交流频率较高, 遗传分化不明显, 初步判定东海带鱼3个群体的遗传多样性偏低。     

曼氏无针乌贼神经肽sCAP基因克隆与组织表达定位

为研究曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)小心激肽(small cardioactive peptides, sCAP)生理功能, 通过RACE技术克隆曼氏无针乌贼sCAP基因(简称SjsCAP, GenBank登录号:MG779491), 得到总长度为696 bp的cDNA序列, 包括111 bp的5′非编码区(UTR)和324 bp的3′UTR, 预测的开放阅读框(ORF)共261 bp, 编码86个氨基酸, 相对分子量(MW)为9.331 kD, 等电点(pI)为8.52。信号肽以及跨膜区预测结果表明, sCAP中含有明显的信号肽序列和跨膜区结构。因此, 推测该蛋白可能由细胞内分泌到细胞外发挥作用。亲水性分析显示该蛋白为亲水性蛋白。基于sCAP氨基酸序列进行的系统进化分析表明曼氏无针乌贼与商乌贼(Sepia officinalis)亲缘关系最近, 相似性达到90%。通过荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术对SjsCAP基因在成熟雄性和雌性曼氏无针乌贼不同组织中的表达量进行分析, 结果显示sCAP主要在视叶中显著表达, 在脑中也有较高的表达量, 其中雄性个体表达量显著高于雌性个体。原位杂交实验结果显示sCAP基因在曼氏无针乌贼的脑组织的视叶、食道上神经团的垂直叶、亚垂直、脑脚叶、背外侧叶和视腺均可以观察到明显的阳性杂交信号。sCAP基因的成功克隆以及组织表达定位分析为sCAP的亚细胞定位以及生物学功能研究奠定一定的基础, 同时为曼氏无针乌贼的种质资源保护与开发提供一定的理论支持。     

基于耳石形态的鱚属鱼类鉴别

利用9个耳石形状指标对我国鱚属鱼类少鳞鱚、多鳞鱚及斑鱚共78个个体的矢耳石形态进行了多元统计分析,同时对3个群体的74个少鳞鱚矢耳石形态进行了判别分析。单因子方差分析结果显示,少鳞鱚与多鳞鱚矢耳石的9个形状指标均存在显著差异(P<0.05);反映耳石长、短轴差异程度的第1主成分与反映耳石三维特征的第2主成分解释了85.943%的形态差异;9个指标在种间判别分析中的综合判别正确率为93.6%,种内判别分析中的综合判别正确率为93.2%。研究表明形状指标法可以作为中国鱚属鱼类鉴别的有效手段。     

粤北石灰岩山地主要造林树种的生理生态学特性

本文是在调查粤北石灰岩山地植被的基础上,选出8种植物进行光能利用效率和蒸腾系数等生理生态学特性研究,并与非石灰岩山地较速生的荷木、藜蒴作比较,以筛选出适合石灰岩山地造林绿化的树种。结果表明,任豆、香椿与荷木、藜蒴的平均净光合速率(gCO2·m-2·d-1)分别为19.92,13.10,9.04和8.11;对光合有效辐射的利用效率(%)分别为4.21,4.59,2.71和2.52;蒸腾速率(gH2O·m-2·d-1)分别为2191,1266,1499和1133;蒸腾系数(gH2O·gDM-1)分别为164,144,244和209．说明任豆、香椿比荷木、藜蒴速生,光能利用效率、水分利用效率高,生态适应性强。光皮树、阴香的生长速度与荷木、藜蒴相似。菜豆树、桂花、铁榄、板栗的生长速度比荷木、藜蒴慢,但除板栗外都比较耐荫,对石灰岩山地环境也有较强的生态适应性。     

结缕草属植物种间关系的SSR分析

以结缕草属的9种1变种共58份种源为材料,利用SSR标记技术进行了多样性分析和种间关系研究。结果表明:结缕草属植物具有很高的遗传多样性;14对SSR引物中,共扩增出267条带,Nei’s基因多样性指数为0.376 0,Shannon多样性指数为0.552 6;属内总基因多样性为0.382 3,种内基因多样性为0.219 6,57.44%的遗传变异存在于种内,基因流为0.674 8,不同的种之间有遗传分化,遗传漂变对该遗传分化有一定的贡献。UPGMA遗传距离聚类分析结果表明,结缕草、中华结缕草、朝鲜结缕草和大穗结缕草聚为一类;沟叶结缕草、小结缕草和细叶结缕草聚为一类;大花结缕草、长花结缕草和太平洋结缕草各自为一类。研究表明,生态地理条件相似的种优先聚集。     

鲫寄生7种指环虫的形态学和分子鉴定

指环虫(Dactylogyrus sp.)是鲫(Carassius auratus)鳃部重要的致病寄生虫, 为调查鲫的指环虫种类, 采用形态学与分子生物学相结合的方法, 对梁子湖鲫的单殖吸虫进行了种类鉴定。通过对指环虫后吸器几丁质结构的形态特征描述和测量, 发现鳃部共有7种指环虫, 分别鉴定为坏鳃指环虫(D. vastator)、中型指环虫(D. intermedius)、弧形指环虫(D. arcuatus)、弓茎指环虫(D. baueri)、美丽指环虫(D. formosus)、望外指环虫(D. inexpeatatus)及叉茎指环虫(D. dulkeiti)。中型指环虫、美丽指环虫和叉茎指环虫与GenBank中相应指环虫的18S+ITS1+5.8S rDNA序列的相似性均高于99.0%, 弧形指环虫的基因序列为首次提交。而坏鳃指环虫与GenBank中相应的指环虫序列相似度仅有96.37%, 遗传距离分析显示, 坏鳃指环虫的种内遗传距离较大(0.004—0.058), 但小于坏鳃指环虫与中型指环虫的种间遗传距离(0.046—0.064)。研究重新描述我国鲫7种指环虫主要形态学分类特征, 并提供分子分类数据, 为鲫寄生指环虫的种类鉴定提供参考依据。