猫科动物DNA条形码及线粒体假基因对物种鉴定的影响

在多种动物类群中,基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的DNA条形码是一种高效的物种鉴别手段,然而猫科Felidae动物中广泛存在的线粒体假基因可能影响DNA条形码的有效性。本研究共涉及猫科动物12属25种119个样本。采用3对条形码通用引物对6属11种29个猫科动物样本进行了扩增及测序。结果3个样本扩增失败,8个样本得到假基因,18个样本获得了条形码序列。结合另外93条猫科动物条形码序列(源自BOLD Systems),采用Kimura 2-parameter模型计算遗传距离,构建Neighbor-Joining(NJ)树。结果显示,遗传距离种内为0%~8.1%,平均0.8%;种间为1.4%~13.1%,平均8.7%;属间为8.2%~21.8%,平均15.1%。NJ树显示,除3个种外,其余物种均以极高的置信度(99%)形成单系分支。而假基因序列有些可以单独形成分支,有些夹杂在COⅠ序列形成的分支中,对物种鉴定产生干扰。     

北京白羊沟景区农林交错带蛾类DNA条形码鉴定

[目的]DNA条形码技术已经在多个类群中得到了广泛应用,但对数量巨大的鳞翅目昆虫而言,仍然缺失大量数据,尤其是形态鉴定较为困难的小蛾类和很多中型蛾类,尚无法构建较为完善的DNA条形码系统.本研究旨在为鳞翅目害虫DNA条形码系统的构建和完善提供数据来源及支撑,验证COⅠ基因作为DNA条形码通用基因的准确性,探讨28S rDNA的D2基因片段作为DNA条形码辅助基因的可行性,并检验目前BOLD系统的鉴定成功率.[方法]对采集自北京白羊沟风景区的小蛾类和中型蛾类490头标本进行形态鉴定和DNA测序,分别基于COⅠ及28S D2基因计算种内种间遗传距离,并构建了NJ系统发育树.[结果]BOLD系统的鉴定成功率为65％,对小蛾类和夜蛾类鉴定成功率较低.基于COⅠ基因的NJ树鉴定成功率为94.4％,基于28S D2基因的NJ树鉴定成功率为89.4％.[结论]结合种内与种间遗传距离结果,COⅠ基因适合作为鳞翅目蛾类DNA条形码通用基因,28S D2基因较为保守,不适合作为DNA条形码的辅助基因.     

果园三种天蛾的DNA条形码鉴定

DNA条形码(DNA Barcoding)可以利用一段通用基因短片段对物种(包括不同生活史阶段)进行区分。本文尝试应用该技术对深色白眉天蛾Hyles gallii(Rottemburg)、构月天蛾Parum colligata(Walker)、桃红六点天蛾Marumba gaschkewitschi(Bremer et Grey)等3种天蛾进行了鉴别。测定了3种天蛾的COⅠ基因序列,并在BOLD(Barcode of Life Data Systems)及GenBank中进行了检索。结果发现BOLD系统比GenBank更能帮助准确鉴定到物种,而在GenBank中只有1种能鉴定到种。将实验室获得序列与GenBank中下载的474条同源序列整合后,利用MEGA4.0的Kimura-2-Parameter模型进行了遗传距离分析,利用MEGA4.0及PAUP4.0进行了系统发育树的构建,结果发现待鉴定标本序列在各个系统发育树的位置基本一致,并能准确鉴定出一种天蛾。本研究表明,随着BOLD系统、GenBank等公共数据库的不断完善,DNA条形码将有助于更加有效地鉴定特定类群物种。     

基于DNA条形码对北京地区蔷薇科花卉上蚜虫的快速鉴定

蔷薇科花卉植物是北京城市绿化的主要观赏植物,也是多种蚜虫的寄主植物。由于蚜虫体型小,形态特征特化或退化,具有复杂的多型现象,依据传统的形态学特征往往无法实现对物种的准确而快速的鉴定,因此会影响对蚜虫的及时有效防治。本研究应用DNA条形码技术,基于COⅠ基因序列分析,对北京地区主要蔷薇科花卉上的蚜虫进行编码,试图在花卉种植和害虫防治时用于物种的快速、准确鉴定。实验得到9属12种蚜虫的65条COⅠ基因序列,种内平均差异为0.70%,种间平均差异为9.45%,最高可达12.59%。基于COⅠ序列构建了NJ树和MP树,绝大多数物种的样品有效地聚为一支,且支持率达到了90%以上,构建的系统发育树可以很好的显示相同物种样品的聚类。结合遗传距离和系统发育树分析表明,基于COⅠ序列的DNA条形码能有效区分83%的北京地区蔷薇科花卉蚜虫物种。     

基于DNA条形码对桃属植物上蚜虫的快速鉴定

桃属(Amygdalus)植物是我国重要的果树,有些种类是常见的城市绿化观赏树种,也是多种蚜虫的寄主。蚜虫的体型小,有复杂的多型现象,传统的形态学特征往往无法实现对物种的准确而快速的鉴定。本研究应用DNA条形码技术,基于COⅠ基因序列分析,对我国桃属植物上的蚜虫进行编码,为桃属植物上蚜虫的物种快速、准确鉴定提供有力的支持。本研究共编码桃属植物上蚜虫12种,其中蚜亚科Aphidinae 6属10种,毛管蚜亚科Greenideinae 1属1种,毛蚜亚科Chaitophorinae 1属1种。共获得COⅠ基因序列96条,种内平均差异为0.76%,种间为5.7%¹5.5%。基于COⅠ序列构建了NJ树,绝大多数物种的样品有效地聚为一支,且支持率达到了95%以上。结合遗传距离和系统发育树分析表明,基于COⅠ序列的DNA条形码能有效区分99%的桃属植物上的蚜虫物种。     

基于线粒体COⅠ基因的齿小蠹属昆虫DNA条形码研究

齿小蠹属（鞘翅目： 小蠹科）昆虫是植物检疫中经常截获的类群, 为探讨线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特定区段作为DNA条形码快速准确鉴定齿小蠹种类的可行性, 以齿小蠹属昆虫为研究对象, 测定分析了线粒体COⅠ基因462 bp碱基序列。序列分析结果显示： 变异位点为259个, 保守位点203个, 简约信息位点181个, 自裔位点78个。所有位点中, A, G, C和T碱基平均含量分别为30.7%, 16.5%, 17.0%和35.8%。A+T含量较高, 为66.5%, 明显高于G+C含量, 表现明显的A+T碱基偏嗜, 且A与T含量相当, 符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。转换与颠换结果显示： 该段序列未达到饱和, 可以得到准确的进化分析。利用Kimura 2-parameter模型分析遗传距离得到, 同物种间的遗传距离介于0.002~0.007之间, 不同种间的遗传距离介于0.056~0.431间, 平均遗传距离为0.199, 说明该段序列能够区分不同物种。基于COⅠ基因序列构建的邻接法系统发育树（NJ树）显示, 同一物种聚为同一小支, 且分支自展值均为100%; 近缘种能聚集在一起, 且置信度很高（≥97%）。结果表明应用基于COⅠ基因片段的DNA条形码进行齿小蠹属昆虫分类鉴定具有可行性。     

印度-西太平洋胡椒鲷亚科鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

为探讨COⅠ基因作为条形码在胡椒鲷亚科鱼类物种鉴定的可行性, 研究测定了胡椒鲷亚科8种鱼类51个个体线粒体COⅠ基因长度为651 bp的序列, 利用MEGA 5.0计算胡椒鲷亚科种内与种间的遗传距离, 基于最大似然法与贝叶斯法构建了系统进化树。结果显示: 胡椒鲷亚科鱼类种间平均遗传距离(0.142)显著大于种内平均遗传距离(0.003), 物种间遗传距离均大于Hebert推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.020(2%)。系统进化树上, 同一物种不同个体间均能形成独立的单系分支, 表明COⅠ基因可作为胡椒鲷亚科物种鉴定的有效条形码基因。研究同时揭示, 在形态分类上被认为是同种异名的两种胡椒鲷(条纹胡椒鲷与东方胡椒鲷)的COⅠ基因序列差异达到0.070, 有可能是两个独立的物种。此外, 在属级水平, 少棘胡椒鲷属与胡椒鲷属种类之间的平均遗传距离小于胡椒鲷属内部种间的遗传距离, 支持少棘胡椒鲷归属于胡椒鲷属的观点。       

三种琥珀螺(Succineidae)基于DNA条形码技术的分类分析

琥珀螺科的传统分类研究主要基于形态特征,由于壳相特征的趋同性以及比较形态解剖学研究基础的不足,中国琥珀螺科系统分类有待深入研究,已报道属种有待厘定。本研究运用DNA条形码技术,对新疆11个地点3种琥珀螺(Succinea daucina, Oxyloma wujiaquensis, Oxyloma sp.)的线粒体COⅠ与16S rRNA基因序列进行分析,并对三者的分类关系进行探讨。通过测序共获取COⅠ(640 bp)与16S rRNA (418 bp)基因序列各69条,其碱基组成均显示出较高的A+T比例(COⅠ:67.91%, 16S rRNA:73.15%),与目前已知琥珀螺线粒体DNA序列特征相符。基于Kimura双参数模型计算:3种琥珀螺的COⅠ基因序列(640 bp)平均种间遗传距离为0.135 6～0.171 3,平均种内遗传距离为0.006 8～0.009 2;16S rRNA基因序列(418 bp)平均种间遗传距离为0.079 3～0.148 1,平均种内遗传距离为0.003 4～0.008 9;3种琥珀螺COⅠ与16S rRNA基因的种间遗传变异均远大于种内遗传变异,存在明显的间隔。采用最大似然法构建分子系统树,结果显示本研究中不同地点的3种琥珀螺分别聚为置信度较高的分支,均有大于95%的支持度。本研究基于DNA条形码技术的分类研究结果与形态学研究结果一致。综上结果表明,COⅠ与16S r RNA基因适用于琥珀螺的物种鉴定。     

部分山雀科鸟类的DNA条形码与物种识别

近年来,DNA条形码(DNA barcodes)被认为是鸟类物种识别和分类的有效手段。采用遗传距离和构树这两种方法检验了线粒体基因COⅠ片断作为DNA条形码区分包括长尾山雀在内的山雀科鸟类的识别效果。此次实验分析了92条COⅠ序列,其中50条来自GenBank,代表了该科的30个物种。分析结果表明:尽管山雀科鸟类呈现出较大的种内变异,但是该科鸟类的种间遗传距离还是远大于种内的遗传距离。COⅠ条形码可识别出大部分的山雀科物种,同时该条形码还可鉴定出亚种组、亚种、甚至地理种群。然而,对于近期分化和存在杂交的物种,COⅠ难以鉴定出。在此情况下,探索应用核基因条形码或者采用基于碱基属性的鉴定方法则可以弥补这一缺陷。比较古北界、东洋界与新北界(北美)的山雀类发现,古北界和东洋界的山雀具有较大的种内变异且种群内具有较大的遗传分化,推测这很可能和第四纪冰川的影响有关。     

苹果园鳞翅目夜蛾科DNA条形码鉴定

为了检验DNA条形码在鳞翅目夜蛾科蛾类鉴定中的可行性,本文对采自北京昌平苹果园内的夜蛾科14种71头蛾类标本分别提取了DNA,并扩增了线粒体cox1及核基因28S,利用系统发育树、遗传距离、阈值等方法进行了鉴定和比较分析。同时,检验了目前BOLD系统的鉴定成功率。实验表明,基于cox1基因和BOLD系统的鉴定成功率达到了100%,而基于28S则很低,为64.8%。用不同方法构建的系统发育树,鉴定结果均相同。93%的种内遗传距离小于1%,94%的种间遗传距离为大于3%,种内种间的遗传距离形成明显的3%阈值现象。     

我国32种鸟类DNA条形码分析

DNA条形码是一种分子分类方法,近年来在物种鉴定方面得到迅速的发展和应用.本研究分析了我国27属32种鸟类(61只)的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的条形码片段,分别用阈值法、聚类法和诊断核苷酸进行了分析,探究DNA条形码鉴定我国鸟类的准确性.结果显示,种内CO Ⅰ序列变异很小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离,DNA条形码序列能够鉴定所有鸟类.     

西太平洋沿海石斑鱼属鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

研究测定了分布于西太平洋沿海的35种石斑鱼属鱼类共142个个体线粒体基因COⅠ及核基因TMO-4C4标记序列, 基于最大似然法与贝叶斯法构建分析了石斑鱼类分子系统进化关系。同时, 探讨了COⅠ基因作为DNA条形码在石斑鱼属鱼类物种鉴定中的有效性问题。结果显示: 35种石斑鱼属鱼类COⅠ同源序列为636 bp, 编码212个氨基酸, TMO-4C4同源序列为486 bp, 编码162个氨基酸, 在COⅠ基因中, 种间遗传距离在0.030—0.202, 平均遗传距离为0.143, 物种间遗传距离均大于Hebert 推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.020(2%)。种内遗传距离0.000—0.008, 平均遗传距离为0.003, 种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的48倍, 显著大于种内平均遗传距离, 表明COⅠ基因可作为石斑鱼属物种鉴定的有效条形码基因。基于COⅠ及TMO-4C4构建的系统进化树上, 35种石斑鱼主要形成2个主要类群, 类群Ⅰ由细点石斑鱼(Epinephelus cyanopodus)和蓝棕石斑鱼(Epinephelus multinotatus)等22种石斑鱼聚成, 类群Ⅱ由吊桥石斑鱼(Epinephelus morrhua)和小点石斑鱼(Epinephelus epistictus)等13种石斑鱼组成。部分存在同种异名争议的种类如云纹石斑鱼(Epinephelus moara)/褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)/马拉巴石斑鱼(Epinephelus malabaricus)经COⅠ及TMO-4C4序列差异及进化分析, 均存在较大的遗传分化。结果支持近期的分类研究, 云纹石斑鱼/褐石斑鱼和斜带石斑鱼/马拉巴石斑鱼均为独立的物种, 并非同种异名的分类。     

基于CO Ⅰ基因的龟鳖目动物鉴定与分类进化分析

为探索COⅠ基因条形码技术在龟鳖目物种分类与鉴定中的适用性,本研究应用通用引物PCR扩增获得龟鳖目动物9科26属45种共205个样品的634 bp COⅠ基因序列片段进行研究分析。结果显示,COⅠ基因在龟鳖目动物中存在少量的碱基插入和缺失,共计12种20个位点,物种占比34.28%;平均碱基含量(A+T)为55.42%,显著高于(G+C)的44.58%。通过Kimura's 2-parameter计算45个物种的种内遗传距离为0～0.023 98,平均为0.003 2;种间遗传距离为0.022 3～0.334 9,平均为0.1 637,种间平均遗传距离约为种内平均遗传距离的51.16倍;有3个物种的种内遗传距离大于Hebert推荐区分物种的最小种间遗传距离0. 02,其中1个物种的种内遗传距离大于45个物种的种间最小遗传距离0.022 3。同科内不同属间及同目内不同科间的遗传距离分别为0.146 7、0.212 7,显示物种间遗传距离随着分类阶元的上升而逐步扩大。系统进化树聚类结果显示,不同个体依据亲缘关系程度不同分别聚为独立的一支,没有出现物种交叉分布,能准确反映个体间的亲缘关系。结果表明利用COⅠ基因鉴定龟鳖目物种具有可行性,但科内属间及以上分类阶元进化节点自展率不高,无法通过COⅠ基因明确其进化关系,须结合其他DNA指标加以确认。     

苹果蠹蛾线粒体DNA COⅠ基因克隆与序列分析

本研究采集新疆阿拉尔地区苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)幼虫,对其线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COⅠ序列进行了分析。结果显示:苹果蠹蛾DNA扩增出的COⅠ基因序列片段长度为709bp,序列中A+T含量极高,占68.7%,而G+C的含量只有31.3%。经基因序列比对,与其它几种食心虫的同源性为85.4%～88.1%,遗传距离为0.130～0.162;采用NJ法构建了卷蛾科系统树,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。本研究结果为苹果蠹蛾快速鉴定的DNA条形码技术研究提供重要基础。     

基于线粒体COⅠ基因DNA条形码的中国鲚属物种有效性分析

分析了150尾刀鲚Coilia nasus、湖鲚C.nasus taihuensis、短颌鲚C.brachygnathus、七丝鲚C.grayii及凤鲚C.mystus个体的COⅠ基因DNA条形码序列变异。结果显示,150条COⅠ基因条形码序列包含63种单倍型,单突变位点主要集中在100bp和600bp附近。刀鲚、短颌鲚和湖鲚群体间的遗传距离在0.253%～0.557%之间,显著低于COⅠ基因DNA条形码鉴别不同物种2%的遗传距离阈值,表明这3个群体应为同一物种。但是凤鲚两群体间的遗传距离为5.08%,大于2%的鉴别阈值,显示凤鲚两群体可能达到了种或亚种级差异水平。以日本鳀Engraulisjaponicus为外群,用邻接法、最大简约法和最大似然法构建了分子系统树显示,刀鲚、湖鲚和短颌鲚群体聚在一起,未能各自形成单系;凤鲚根据地理分布聚为两支;七丝鲚则聚成单系。研究表明COⅠ基因条形码技术可用于我国鲚属物种的鉴定。     

基于线粒体COⅠ基因的沙鳅亚科鱼类DNA条形码及其分子系统发育研究

选择线粒体COⅠ基因作为分子标记,进行沙鳅亚科鱼类（Botiinae）DNA条形码及其分子系统发育研究。研究获得了沙鳅亚科7属19种共131个个体的COⅠ基因序列,利用MEGA5.0软件分析了沙鳅亚科鱼类COⅠ基因的序列特征,计算了种内及种间遗传距离。沙鳅亚科鱼类的分子系统发育关系的重建分别采用NJ法和Bayesian法。研究发现,沙鳅亚科COⅠ基因的碱基组成为: A 24.4%、T 29.5%、G 18.0%、C 28.1%。沙鳅亚科鱼类种内平均遗传距离为0.0020.000,种间平均遗传距离为0.1480.008。DNA条形码研究结果显示,所分析的19种沙鳅鱼类各自分别聚成单系分支,表明COⅠ基因在本研究中具有100%的物种鉴别率。同时,系统发育分析支持各属的单系性,并且结果显示沙鳅亚科鱼类聚为两个分支,其中一支由薄鳅属和副沙鳅属构成,另一分支则包括: （沙鳅属、色鳅属）和 中华沙鳅属、（缨须鳅属、安彦鳅属）。因此,COⅠ基因可以作为有效的分子标记对沙鳅亚科进行DNA条形码研究以及分子系统发育研究。       

斑腿蝗科Catantopidae七种蝗虫线粒体COⅠ基因的DNA条形码研究

以我国常见的斑腿蝗科Catantopidae7种蝗虫为对象测定了COⅠ基因序列,探讨COⅠ基因作为DNA条形码在识别蝗虫物种方面的可行性。结果表明,斑腿蝗科3属7种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以探讨蝗虫属、种分类单元的系统发育问题,为将线粒体基因组的COⅠ基因作为蝗虫DNA条形码进行分类鉴定手段的可行性提供一定的参考。     

慈竹叶蝉类害虫DNA条形码分析

叶蝉类昆虫形态结构多样,在农林生态系统的物种多样性和植物保护工作中扮演着重要角色,但其物种的准确鉴定一直是农林植保工作中的难点。DNA条形码技术极大促进了农林生态系统物种的快速、准确鉴定。本研究经过连续2年的野外调查采集慈竹Bambusa emeiensis主要叶蝉种类,扩增了广泛分布于中国慈竹的12种主要叶蝉类害虫的线粒体基因COⅠ和16S rRNA序列片段,并进行了遗传距离、系统发育及矢量Klee-diagram图分析。结果显示:慈竹叶蝉昆虫COⅠ基因序列片段(590 bp)种内遗传距离为0.004,种间遗传距离为0.283;16S rRNA基因序列片段(463 bp)种内遗传距离为0.003,种间遗传距离为0.257;不同种间存在明显的条形码间隔。2个基因序列片段的分子系统发育分析结果与形态学研究谱系关系一致。Klee-diagram图分析结果和分子系统发育结果一致。上述结果表明,COⅠ和16S rRNA基因适用于慈竹叶蝉类昆虫的物种鉴定,可为竹林叶蝉类昆虫的准确快速鉴定提供参考方法。     

基于线粒体CO 1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用

本研究探讨了线粒体CO1基因作为DNA条形码对鲌属鱼类进行物种鉴定的可行性。研究中获得了鲌属4种鱼类共32个个体长度为816bp的CO1基因序列。利用MEGA软件计算鲌属鱼类种间及种内遗传距离,利用邻接法、最大简约法、最大似然法和Bayesian方法分别构建分子系统树。结果显示,鲌属鱼类的种间遗传距离显著大于种内遗传距离。在系统树中,鲌属鱼类每一物种的个体分别形成各自独立的分支。基于CO1基因的DNA条形码在识别鲌属鱼类物种方面和传统形态学基本一致,而且该基因可以探讨鲌属鱼类种间的系统发育关系。本研究表明以CO1基因作为鲌属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。     

DNA条形码技术在田间常见蓟马种类识别中的应用

蓟马类害虫种类多、 体型小, 传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。本研究利用DNA条形码通用型引物, 以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ gene, mtDNA COⅠ) 基因 (约650 bp), 通过对靶标片段碱基序列的测序及比对分析, 以邻接法 (NJ法) 构建系统发育树, 并以Kimura双参数模型计算种内、 种间遗传距离。结果表明： 聚类分析与形态学鉴定结果一致, 表现为较长的种间分支和较短的种内分支, 每个单系分支对应一个物种, 同一物种不同单倍型的最初分支自展值均为100%。25种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027, 种间平均遗传距离为0.2757, 种间遗传距离为种内遗传距离的102.1倍; 而且种内、 种间遗传距离没有重叠区域。结果说明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别。