应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇

【目的】辣椒实蝇Bactrocera latifrons(Hendel)为我国重要的检疫性有害生物,其寄主范围广泛,危害严重。由于传统鉴定方法受到饲养周期、饲养条件、虫态等因素的限制,使得果蔬进出口贸易通关速度、疫情快速鉴定受到较大的影响,因此迫切需要开发关于实蝇的快速鉴定识别的技术。【方法】本研究基于mt DNA COI序列设计了一对能够准确鉴定辣椒实蝇的种特异性引物FL680和RL1057,选用辣椒实蝇作为阳性对照,选用番石榴实蝇B.correcta(Bezzi)、桔小实蝇B.dorsalis(Hendel)和颜带实蝇B.cilifer(Hendel)等20种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】仅目标种辣椒实蝇能够扩增出清晰且单一的约378 bp的条带,其余实蝇种类均未出现条带。将本实验建立的种特异性PCR(SS-PCR)鉴定方法应用于实际检疫工作中并得到了验证,表明该方法具有强的种特异性。【结论】本文提出辣椒实蝇快速鉴定识别技术可应用于实蝇的疫情监测和口岸的检疫检测工作。     

实蝇类害虫分子鉴定研究进展

随着国际贸易活动的日趋频繁及其复杂化,实蝇类害虫的传播扩散机率越来越大,直接威胁农业生产安全,成为影响果蔬等进出口贸易的重要检疫问题之一。因此,实蝇的准确识别与快速鉴定受到了世界各国的高度重视。本文主要对目前已经被用于实蝇鉴定的分子生物学技术的原理、优缺点及其研究进展进行概述;同时,根据BOLD Systems现有的数据,汇总了截至2014年10月22日实蝇DNA条形码的种类、已公布研究的记录数及涉及的实蝇种类。结果表明:目前应用于实蝇鉴定的DNA条形码有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7种;其中以COⅠ标记为主,已公布的记录数为4540,是其他5种DNA标记的113.5倍,COⅠ-5P标记研究的实蝇科种类有315种,COⅠ-3P标记的有116种;目前研究较多的为果实蝇属、寡鬃实蝇属、腊实蝇属。本文对今后选用分子生物学技术鉴定实蝇种属具有重要的理论意义。     

基于性诱和深度学习的草地贪夜蛾成虫自动识别计数方法

【目的】探究深度学习在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda成虫自动识别计数上的可行性,并评估模型的识别计数准确率,为害虫机器智能监测提供图像识别与计数方法。【方法】设计一种基于性诱的害虫图像监测装置,定时自动采集诱捕到的草地贪夜蛾成虫图像,结合采集船形诱捕器粘虫板上草地贪夜蛾成虫图像,构建数据集;应用YOLOv5深度学习目标检测模型进行特征学习,通过草地贪夜蛾原始图像、清除边缘残缺目标、增加相似检测目标(斜纹夜蛾成虫)、无检测目标负样本等不同处理的数据集进行模型训练,得到Yolov5s-A1, Yolov5s-A2, Yolov5s-AB, Yolov5s-ABC 4个模型,对比在不同遮挡程度梯度下的测试样本不同模型检测结果,用准确率(P)、召回率(R)、F1值、平均准确率(average precision, AP)和计数准确率(counting accuracy, CA)评估各模型的差异。【结果】通过原始图像集训练的模型Yolov5s-A1的识别准确率为87.37%,召回率为90.24%,F1值为88.78;清除边缘残缺目标图像集训练得到的模型Yolov5s-A2的识别准确率为93.15%,召回率为84.77%,F1值为88.76;增加斜纹夜蛾成虫样本图像训练的模型Yolov5s-AB的识别准确率为96.23%,召回率为91.85%,F1值为93.99;增加斜纹夜蛾成虫和无检测对象负样本训练的模型Yolov5s-ABC的识别准确率为94.76%,召回率为88.23%,F1值为91.38。4个模型的AP值从高到低排列如下：Yolov5s-AB>Yolov5s-ABC> Yolov5s-A2>Yolov5s-A1,其中Yolov5s-AB与Yolov5s-ABC结果相近;CA值从高到低排列如下：Yolov5s-AB>Yolov5s-ABC>Yolov5s-A2>Yolov5s-A1。【结论】结果表明本文提出的方法应用于控制条件下害虫图像监测设备及诱捕器粘虫板上草地贪夜蛾成虫的识别计数是可行的,深度学习技术对于草地贪夜蛾成虫的识别和计数是有效的。基于深度学习的草地贪夜蛾成虫自动识别与计数方法对虫体姿态变化、杂物干扰等有较好的鲁棒性,可从各种虫体姿态及破损虫体中自动统计出草地贪夜蛾成虫的数量,在害虫种群监测中具有广阔的应用前景。     

小菜蛾基因组中内源性逆转录病毒元件PxERV的发现与特征分析

【目的】内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses, ERVs)是一类在宿主基因组中世代留存的有类似病毒结构的序列元件。本研究在通过前期小菜蛾Plutella xylostella精巢转录组分析发现一个小菜蛾内源性逆转录病毒元件PxERV的基础上，探究该逆转录病毒元件的序列特征及侵染活性，为探明内源性逆转录病毒对小菜蛾的影响奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析鉴定了PxERV在小菜蛾基因组上的序列及结构特点，并用基因克隆和测序得到PxERV的env基因序列；进一步通过MEGA6软件构建了昆虫env基因编码的氨基酸序列与核型多角体病毒包膜糖蛋白的系统发育树。利用qPCR技术检测了env基因在小菜蛾G88品系不同发育时期虫体和精巢中的表达模式及FZ品系成虫和G88品系的成虫和幼虫中env基因拷贝数的变化。利用CRISPR/Cas9介导小菜蛾G88品系中env基因突变，检测PxERV的独立复制活性。【结果】PxERV有LTR-pol-env-LTR结构，其env基因与果蝇Drosophila buzzatii逆转座子osvaldo和粉纹夜蛾Trichoplusia ni内源性逆转录病毒Ted的env基因进化关系较近。PxERV的env基因在小菜蛾G88品系雄成虫精巢中特异性高表达，env基因的拷贝数在小菜蛾FZ品系中的低于在G88品系中的，但在不同发育时期的G88品系中没有差异。G88品系多代自交，突变型env基因在小菜蛾基因组上不断减少，直至完全恢复野生型env基因。【结论】内源性逆转录病毒元件PxERV在小菜蛾世代间存在独立复制活性，但在小菜蛾发育过程中不会独立复制。这种病毒元件可能通过小菜蛾雄性生殖系统实现侵染活性，但侵染机理还需进一步探究。