北京地区7种常见嗜尸性蝇类的COI基因序列分析及DNA条形码的建立

嗜尸性蝇类在命案死亡时间和现场推断方面有着十分重要的应用, 而DNA 条形编码技术能摆脱对虫卵和幼虫的饲养以及后续物种鉴定方面专业知识的依赖, 有助于实现现场采集蝇类样本的快速鉴定。本研究采集了北京地区7个嗜尸性蝇类优势种共77个个体的样本, 测定了所有个体线粒体DNA 上细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COI）基因1 120 bp的序列。基于序列的系统发生分析显示, 同一物种不同个体的序列均以高达99%的支持值聚集在一起。序列间的分歧统计表明这些蝇类在物种内的个体分歧不超过1%, 而不同物种间的净分歧均超过7.74%, 最高可达14.85%。滑动窗口分析表明, 在整个序列区段种间差异位点存在较平均的分布。通过测定COI基因的序列, 建立了北京地区7个嗜尸性蝇类优势种的DNA条形码, 据此实现了对这些物种准确、快速、简单的区分和鉴定, 同时也为后续应用于物种鉴定的种属特异性位点之筛选提供了基础数据。     

分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

mtDNA中COⅠ分子标记在常见食尸性蝇类鉴定中的应用

死后不同时间,在尸体上出现不同种类食尸性蝇类的演替规律,可用于准确推断死亡时间。传统上仅依据蝇类形态学特征来判断种属,但由于蝇类的形态结构复杂和种间形态差异微小等特点,对蝇类尤其是对蝇类幼虫的种属鉴别很难。因此应用分子生物学方法对食尸性蝇类及其幼虫进行种属鉴定非常重要。本研究主要是利用此方法对我国西部部分地区常见双翅目食尸性蝇类包括：开普黑蝇、大头金蝇、丝光绿蝇及部分卵,铜绿蝇、棕尾别麻蝇及部分幼虫和蛹的线粒体DNA(mtDNA)上细胞色素氧化酶辅酶Ⅰ(COⅠ)中278 bp的基因序列进行鉴别。除个别蝇类如丝光绿蝇与铜绿蝇外,该方法均能有效地将上述食尸性蝇类鉴定到种属水平。在我国,它将成为法医鉴别食尸性蝇类种属的可靠依据。     

限制性酶

核酸限制性内切酶是识别双链DNA中专一序列的酶,主要从原核生物中提取。限制性内切酶可分为三类:第Ⅰ和第Ⅲ类酶在同一旦白中具有修饰作用(甲基化作用)和需要ATP的限制性裂解的活性。这两种酶都识别底物DNA中非甲基化的序列,不过第Ⅰ类酶的作用是随机的,第Ⅲ类酶则切DNA的专一位点。     

基于SAFLP的我国常见索线虫科昆虫病原线虫亲缘关系分析

本研究建立并优化了索线虫科(Mermithidae)SAFLP体系,构建了我国常见索线虫科昆虫病原线虫6属11种/亚种的指纹图谱。采用EcoRⅠ和MseⅠ两种限制性内切酶单酶切,结果显示EcoRⅠ酶更适合作为索线虫科线虫SAFLP的内切酶。3个带有3个选择性碱基的EcoRⅠ引物进行扩增共得条带225个,片段大小为250～1 650 bp。通过NTsys-PC2.1软件计算了索线虫科6属11种/亚种的Nei-Li遗传距离(0.1980～034554)和相似系数,利用NTsys-PC2.1软件中的UPGMA方法构建其聚类图。索线虫科这6属11种/亚种从属级阶元可以分为两大类群：罗索属Romanomermis和八腱索属Octomyomermis聚为一支构成第一大类群;六索属Hexamermis与卵索属Ovomermis先聚在一起然后与多索属Agamermis聚在一起,再与两索属Amphimermis聚在一起构成第二大类群。在八腱索属和两索属中属内不同种/亚种间线虫采集地相距较近的其遗传距离较近。优化的索线虫科线虫SAFLP体系能够反映索线虫科线虫种属间的亲缘关系,并与形态学的研究结果基本相符,可以用于属种的分类和亲缘关系的研究。     

基于16S rDNA序列的Wolbachia的检测及分型

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生细菌。采用16S rDNA特异片段的PCR-RFLP方法对烟粉虱Bemisia tabaci （Gennadius）不同生物型及米蛾Corcyra cephalonica （Stainton）共生菌Wolbachia进行了检测与分型分析。基于wsp基因对烟粉虱共生菌B组Wolbachia以及米蛾共生菌Wolbachia进行了系统树分析,并对相应的Wolbachia16S rDNA特异片段进行了克隆、测序以及序列比对。结果表明:16S rDNA的特异片段经NheⅠ酶切后RFLP图谱可有效检测与鉴别Wolbachia。烟粉虱共生菌Wolbachia的16S rDNA特异片段经VspⅠ酶切后可得到预期RFLP图谱,而米蛾共生菌B组Wolbachia （基于wsp序列分析为B组）则产生不同的RFLP图谱。序列分析表明,Nauru型烟粉虱体内B组Wolbachia的16S rDNA片段序列与已知B组Wolbachia对应序列（DQ278884）同源性为100%;米蛾体内B组Wolbachia 16S rDNA特异片段有碱基变异,并存在于VspⅠ识别位点内,这是导致VspⅠ酶切后RFLP图谱不同的原因。结果提示,B组Wolbachia 16S rDNA特异片段经VspⅠ酶切的RFLP图谱存在多态性。本研究结果可为今后Wolbachia的检测与分型提供借鉴。     

基于PCR-RFLP技术鉴定常见食源性致病菌

根据细菌核糖体基因16S rRNA保守端400 bp大小区段特征设计引物,应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立一种新型灵敏的食源性致病菌鉴定技术。首先用特异性引物对9属19种细菌基因进行PCR扩增,扩增产物应用7种限制性内切酶Eco52Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ进行消化酶切,再利用琼脂糖凝胶电泳分辨酶切DNA片段大小数目,分析不同种属细菌酶切产物态型,从而进行基因型鉴别,针对16S rRNA基因片段利用RFLP进行分析,结果表明:19种致病菌表现出10种特异性的RFLP图谱,可准确鉴定区分9属细菌,最低检测限可以达到1 pg/μL。这证明PCR-RFLP技术可用于常见食源性致病菌的快速鉴定。     

利用PCR-RFLP技术对鲫鱼6个不同品系的鉴定

采用PCR-RFLP方法分析鲫鱼不同品系mtDNA ND3/ND4L/ND4基因片段,对野鲫、异育银鲫、红鲫、白鲫、彩鲫及金鱼的基因片段进行测序,测序结果用RESearch-version1.0软件对限制性内切酶特异性位点进行分析,最终选择MvaⅠ核酸限制性内切酶对目的基因片段进行酶切,同时引入鲤鱼作为外类群,构建了系统树.酶切结果分析表明,基于聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析能快速而准确地区分鲫鱼的4个不同品系,首次提出异育银鲫和浙江地区野鲫(河鲫鱼)在mtDNAND3/ND4L/ND4基因上的分子鉴定法,为物种鉴定提供了一定的理论研究基础.但野鲫、金鱼、彩鲫的基因序列两两只有一个碱基的差异,相似度接近100％,用酶切软件(RESearch-version1.0)进行分析后未能找到区别三者的限制性内切酶位点,这一结果也验证了关于金鱼、彩鲫起源于野鲫的观点.     

林氏果蝇线粒体DNA分析

本文对Tamura(1988)提纯mtDNA的方法进行改进,建立了林氏果蝇Drosophila lini 线粒体DNA大量制备的方法;对采自原产地台湾省的单雌晶系TAW3146.1的线粒体DNA用10种限制性内切酶进行了酶切,得出了林氏果蝇mtDNA的分子量大小为16.3kb;用双酶切法制作了林氏果蝇线粒体DNA酶切图谱,并与属于同一复合种组的D.Kikkawai的酶切图谱进行比较。所用的内切酶有XbaI、AvaI、EcoRV、ScaI、SacI、EcoR I、HindIII、PvuⅡ、BamHI、PstⅡ。     

毛囊蠕形螨与皮脂蠕形螨基因组DNA的RAPD分析和序列比对

【目的】分析毛囊蠕形螨Demodex folliculorum（D.f.）和皮脂蠕形螨D. brevis（D.b.）基因组DNA的多态性, 对相关条带进行测序分析。【方法】采用改良小昆虫DNA提取法提取两种人体蠕形螨基因组DNA, 选择RAPD技术对其进行多态性分析, 将相关条带分别与pMD18-T载体连接, 克隆、测序后进行酶切鉴定和分析。【结果】毛囊蠕形螨共扩增15条带, 皮脂蠕形螨共扩增12条带;两种蠕形螨既有共有条带, 又有特异性条带;根据条带差异计算得到两种间的遗传距离为0.5556. 毛囊蠕形螨约800 bp处特异性条带测序结果显示, 序列片段长度为855 bp（GenBank登录号为FI277970）;特异性引物扩增和酶切鉴定均为毛囊蠕形螨所特有. 序列比对显示与阿糖胞苷DNA区域结合蛋白有46%的序列相似度。两种人体蠕形螨约300 bp处共有条带序列分析显示, 碱基序列均为341 bp（GenBank登录号分别为D.f. FI520176;D.b. FI520175）, 在第84和第165位点有2个碱基不同, 分别是A/G和C/T互换, 同源性高达99.4%. 但未发现有开放阅读框和相似度高的序列。 【结论】序列片段为855 bp的特异性条带为毛囊蠕形螨所特有;341 bp碱基序列为毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨所共有, 同源性高达99.4%. RAPD技术可用于两种人体蠕形螨基因组DNA的多态性分析和物种鉴定。     

成都地区四种食尸性蝇类 mtDNA中 COⅠ基因序列检测

通过检测食尸性苍蝇线粒体DNA(mtDNA)上细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)中278bp 基因序列,鉴定食尸性苍蝇的种类,解决依据形态学方法不能鉴定苍蝇卵的种类、很难鉴定幼虫种类的难题 ,作为法医鉴别食尸性苍蝇及其幼虫、卵种类依据。随机采集放置在成都地区室外草地兔尸体 上的4 种15个食尸性苍蝇。利用改进的小型昆虫DNA匀浆方法提取上述苍蝇mtDNA;通过Perkin Elmer 9600扩增仪进行PCR扩增;聚丙烯酰胺非变性凝胶连续缓冲体系垂直电泳和银染显色技 术进行扩增结果检测;PCR胶回收试剂盒纯化;ABI 377测序仪测序;MEGA2.1软件包进行序列 分析和构建系统发育树。在双翅目食尸性苍蝇的种内进化分歧均数小于1%,种间进化分歧均数 大于7%。mtDNA上COⅠ序列分析能有效地对主要的食尸性苍蝇进行种类鉴定。该检测方法快速、 简便和精确,能作为法医鉴别食尸性苍蝇种类的可靠依据。     

地中海实蝇及其近缘种基因芯片检测研究

本研究选择线粒体DNA (mtDNA) 细胞色素氧化酶Ⅰ基因（COⅠ）为分子标记基因,以双翅目实蝇科昆虫DNA序列为目标,建立了我国进境植物检疫害虫地中海实蝇Ceratitis capitata、芒果小条实蝇C. cosyra和纳塔尔小条实蝇C. rosa等生物芯片检测方法。地中海实蝇及其近缘种检测芯片由检测探针（实蝇科通用探针1条,小条实蝇属通用探针1条,地中海实蝇、芒果小条实蝇和纳塔尔小条实蝇近缘种探针2条和种特异探针4条）、质控探针（定位点探针、阳性质控、阴性质控和空白对照探针各1条）组成。芯片检测结果表明,检测探针特异性强,能实现上述3种实蝇的种类快速区分和准确鉴定; 检测方法稳定性好,地中海实蝇不同虫态（卵、幼虫、蛹和成虫）和不同地理种群检测结果完全一致。地中海实蝇生物芯片检测技术将为我国进口果蔬中检疫性实蝇快速筛查和种类鉴定提供检测方法,同时,还可应用到其他属的实蝇以及相关害虫的检疫中,为有害生物的快速鉴定提供了新方法。     

Identification of forensically important blow fly species (Diptera: Calliphoridae) in China by mitochondrial cytochrome oxidase I gene differentiation

Abstract Unambiguous and rapid sarcosaphagous insect species identification is an essential requirement for forensic investigations. Although some insect species are difficult to classify morphologically, they can be effectively identified using molecular methods based on similarity with abundant authenticated reference DNA sequences in local databases. However, local databases are still relatively incomplete in China because of the large land area with distinct regional conditions. In this study, 75 forensically important blow flies were collected from 23 locations in 16 Chinese provinces, and a 278‐bp segment of the cytochrome oxidase subunit I gene of all specimens was successfully sequenced. Phylogenetic analysis of the sequenced segments showed that all Calliphorid specimens were properly assigned into nine species with relatively strong supporting values, thus indicating that the 278‐bp cytochrome oxidase subunit one region is suitable for identification of Calliphorid species. The clear difference between intraspecific threshold and interspecific divergence confirmed the potential of this region for Calliphorid species identification, especially for distinguishing between morphologically similar species. Intraspecific geographic variations were observed in Lucilia sericata (Meigen, 1826) and Lucilia caesar (Linnaeus, 1758).     

利用mtDNA COⅠ基因序列鉴定我国烟粉虱的生物型

利用mtDNA COⅠ基因片段作标记,采用序列分析的方法,从分子生态学的角度研究了近年来在我国暴发危害的烟粉虱Bemisia tabaci 5个种群（北京一品红种群,广州甘蓝种群,西安一品红种群,北京西红柿种群和新疆吐鲁番棉花种群）的生物型。在5个种群的基因片段上,截取与Texas-B型相应的720bp的序列分析,结果表明所测序列中只有2个碱基与Texas-B型不同,序列相似性为99.7%;在西安一品红种群和新疆吐鲁番棉花种群的原序列中截取与Arizona-B型序列相应的423bp片段,分析表明这两个种群与AZB3型属于同一个单倍型。因此,我国烟粉虱5个实验种群的生物型与Texas-B型和Arizona-B型种群为同一生物型“B”。     

基于线粒体COⅠ基因序列的小萤叶甲属部分种类分子系统学研究（鞘翅目：叶甲科：萤叶甲亚科）

本文目的是通过对小萤叶甲属部分种类的线粒体COⅠ基因进行比较,探讨小萤叶甲属昆虫进化与寄主植物之间的关系,同时对几种分类地位模糊的昆虫进行分析和归类。测定了我国菱角萤叶甲Galerucella birmanica Jacoby和褐背小萤叶甲Galerucella grisescens Joannis以及小猿叶甲Phaedon brassicae Baly线粒体COⅠ基因720 bp序列,并调用GenBank中小萤叶甲属等其他8种昆虫的同源序列,对序列的碱基组成、转换颠换、遗传距离等进行了分析。并以小猿叶甲为外群,分别采用邻接法（NJ）、最大简约法（MP）和贝叶斯推论法（BI）建立这些种的分子系统发育关系。序列分析结果表明：小萤叶甲属昆虫COⅠ基因A+T含量平均为71.8％,存在较强的A+T含量偏向性,氨基酸的变异率为18.3％; 小萤叶甲属与外群之间的遗传距离(0.169～0.198)远远大于属内种间的距离(0.001～0.134)。依据分子系统树结果我们推测小萤叶甲属昆虫的进化与寄主植物之间有着显著的关系,在传统分类学上曾隶属于其他属的几种昆虫与小萤叶甲昆虫有着更近的亲缘关系。     

针叶小爪螨板栗和杉木种群间的遗传分化和杂交试验

为明确针叶小爪螨Oligonychus ununguis（Jacobi）山东板栗种群和浙江杉木种群的遗传分化程度,本研究对其基因序列（线粒体COⅠ和核糖体ITS2）进行了比较,并通过杂交试验测定了两者间的杂交亲和性.采用PCR产物直接测序法获得410 bp的COⅠ片段及469 bp（板栗种群）和513 bp（杉木种群）的完整ITS2序列,COⅠ及ITS2序列在两种群间的差异分别为10.5%~10.8%和15.2%~15.7%.杂交试验表明两种群间存在完全的生殖隔离.根据两者间的序列差异和杂交结果,初步认为山东板栗和浙江杉木上的小爪螨可能是两个不同的种     

上海地区最常见嗜尸性蝇类三龄幼虫图解检索表

本文提供上海地区最常见嗜尸性蝇类三龄幼虫图解检索表,共4科11种.该检索表可用于案发现场法医昆虫的分类鉴定,进而推断尸体的死亡时间,也可用于重要有瓣蝇类幼虫的孽生地调查.     

桔小实蝇线粒体基因组全序列及其分析

桔小实蝇Bactrocera dorsalis线粒体基因组全序列对研究实蝇分子系统进化具有重要意义。本研究通过DNA测序和克隆技术,对桔小实蝇mtDNA全序列进行了测定和分析。结果表明：桔小实蝇线粒体基因组全长15 915 bp（GenBank序列号: DQ845759）。基因组碱基组成为39.3%A,16.2%C,10.2%G,34.3%T,由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因以及一个非编码的控制区域（A+T-rich区）组成。7个蛋白编码基因和13个tRNA基因从J链编码,其余6个蛋白编码基因和9个tRNA基因从N链编码。位于J链上的蛋白编码基因具有近似的A、T含量,而位于N链上的蛋白编码基因的A的含量明显高于T的含量。以mtDNA COⅠ基因为例,比较了桔小实蝇与其他14种实蝇的亲缘关系,结果显示其与同亚属（果实蝇亚属Bactrocera）内的其他近缘种相互间的同源性很高。     

入侵害虫西花蓟马及其他8种常见蓟马的分子鉴定

用PCR产物直接测序法对入侵害虫西花蓟马和其他8种蓟马的线粒体 COⅠ基因433 bp片段测序，获得62个个体的序列。分子数据分析显示： 种内个体间平均遗传距离在0～0.005之间，2003年在北京发现的西花蓟马与欧洲等地区报导的西花蓟马不存在明显的遗传差异； 9种蓟马种间平均遗传距离为0.213。构建的NJ树可以很好的显示蓟马的聚类，物种各单元型最初分支自展值均达到100%。结果表明，基于PCR及直接测序技术的分子鉴定可以达到准确鉴定蓟马物种之目的。