2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒感染状况

摘要：目的 了解2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒的感染情况,及时掌握诺如病毒的流行趋势,提高防控能力。方法 对2015年大连市10家哨点医院采集的1 247份标本进行诺如病毒荧光定量RT-PCR检测。结果 诺如病毒核酸检测总阳性率为1.92%,其中GⅡ型 性率1.60%,GⅠ型阳性率0.32%。结论 大连市首次在急性胃肠炎病例中监测到GⅠ型诺如病毒,2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒感染以GⅡ型为主。     

贵州省2011年急性胃肠炎诺如病毒的哨点监测及其基因特征分析

为了解贵州省2011年诺如病毒的基因型,监测了2011年5月至12月于贵州省人民医院就诊的急性胃肠炎病例,收集粪便标本,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)初步鉴定,并对阳性株的VP1基因区克隆及测序。检测标本70份,GⅠ型诺如病毒阳性1株,阳性率1.43%,GⅡ型诺如病毒阳性34株,阳性率48.57%,获得7份GⅡ型诺如病毒VP1基因序列,3株为GⅡ.4亚型,为新型变异株(GⅡ4 2011),与GⅡ4 2006b变异株的亲缘关系最近,有1个氨基酸位发生了回复突变;4株为GⅡ.3亚型,分为2个基因簇,1簇与2008～2009年韩国株(HM635118)及上海株(GU991355)的亲缘关系最近,1簇与2010年日本株(AB629943)及2007年印度株(EU921389)等的亲缘关系最近,有4个氨基酸位点易发生回复突变。     

埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测。根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测。该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3~4h。本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断。     

大连地区食源性腹泻病例中诺如病毒基因特征分析

目的了解大连地区食源性腹泻病例中诺如病毒的基因特征。方法采用荧光定量RT-PCR对2016年大连市食源性疾病监测哨点医院采集的1 900份粪便标本进行诺如病毒核酸检测,用逆转录PCR对阳性毒株的ORF1-ORF2连接区扩增并测序,分析其基因亚型和同源性。结果 1 900份标本中,检出诺如病毒核酸阳性25份,阳性率1.32%,其中GⅠ型阳性3份,GⅡ型阳性19份,GⅠ型和GⅡ型均阳性3份。26株病毒基因序列比对,发现3株为GⅠ.3,2株为GⅠ.6,9株为GⅡ.17,5株为GⅡ.4,2株为GⅡ.2,GⅡ.3、GⅡ.6、GⅡ.13、GⅡ.14、GⅡ.15各1株。结论大连地区食源性腹泻病例中诺如病毒呈基因多样性,2016年流行优势株为GⅡ.17。GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.6、GⅡ.13、GⅡ.14、GⅡ.15在大连地区首次检出。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2TCID50/m L的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。结论建立的MNV荧光定量RTPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.95%~1.69%(n=5),批间试验CV为0.87%~1.24%(n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

双重实时逆转录PCR检测G2、G3型轮状病毒方法的建立

目的建立一种双重实时逆转录PCR,用于G2、G3型轮状病毒的快速检测和定量分析。方法采用G2、G3型轮状病毒VP7基因特异性引物/探针和体外转录RNAs,建立双重实时逆转录PCR,在同一反应管中同时检测G2、G3型轮状病毒VP7基因;并对该方法的灵敏度、重复性、有效性进行验证。结果双重实时逆转录PCR标准曲线R~2>0.99,扩增效率在90%～110%之间。灵敏度可达10~1拷贝,不同浓度体外转录RNAs重复性检测CV均≤4.18%。单重和双重实时逆转录PCR均可以对G2、G3型单价样本和混合样本进行有效检测,试验内CV均≤2.08%,试验间CV均≤2.52%。单重和双重实时逆转录PCR检测同一样本时具有良好的一致性,检测结果之间差异无统计学意义(P>0.05),两种方法相关性较好(R~2>0.95)。结论本方法特异、快速、灵敏且重复性好,可以在同一反应管中同时检测两种目的基因,缩短了检测周期,降低了检测成本和污染风险,为轮状病毒的分型和定量提供了更为快速、有效的检测方法。     

人偏肺病毒TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人偏肺病毒(hMPV)核酸特异的快速、敏感的TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法.方法:分别设计hMPV特异的引物与荧光标记探针,合成hMPV绝对定量RNA模板,建立实时荧光定量PCR方法,并与常规RT-PCR平行比较,对其灵敏性、特异性和可重复性,以及用于临床样本的适用性等进行评价.结果:本方法可对hMPV进行特异性诊断,检测灵敏度可达10拷贝/25 μL,检测线性范围至少可达10 1～10 6拷贝/反应,且实验重复性好,初步应用于北京地区采集的158份临床鼻咽拭子标本,定量RT-PCR检出31份标本阳性,明显高于常规RT-PCR方法(22/158).结论:建立了人偏肺病毒TaqMan-MGB探针定量RT-PCR检测方法,并初步证实可用于临床鼻咽拭子标本的检测,为开展hMPV的流行监测及临床早期诊断提供了技术手段.     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

SYBR Green I荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数 (CV) 为0.95％~1.69％ (n=5),批间试验CV为0.87％~1.24％ (n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究

自行设计一种适合野外现场采样的病毒采集浓缩仪,采用一种新型阳离子膜NanoCeram,进行环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究。通过预实验,考察了预处理膜、不同的二次浓缩方法、不同洗脱液对病毒回收率的影响,随后优化整个浓缩过程并确定最佳的病毒浓缩方法。结果显示,预处理膜对病毒回收影响较大,PEG-NaCl沉淀、硅藻土吸附这两种二次浓缩方法的效果相当,选择0.15mol/L Na2HPO4作为硅藻土洗脱液。确定了NanoCeram阳离子膜的病毒回收率为3.02%。最后对北京市丰台区洋桥生活污水进行现场采样,成功检测到GⅡ型诺如病毒,证明该方法有效可行,适合于环境水体中诺如病毒的浓缩分离和检测。     

寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒(ZIKV virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)以及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示:三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。     

2010年深圳地区诺如病毒的基因分型

了解2010年深圳地区诺如病毒的基因型别及分子流行病学特点。 用诺如病毒特异性引物（GI-SKF/GI-SKR、COG2F/G2-SKR）,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法进行诺如病毒核酸扩增,阳性产物回收纯化并测序,用Clustal W和MEGA4.0生物软件对诺如病毒序列进行序列比对和系统进化分析。 85份阳性标本中有79株诺如GⅡ型和6株诺如GⅠ型,其中55株为GⅡ/4(2006b)型,16株为GⅡ/4(2008variant)型,2株为GⅡ/1型,4株为GⅡ/5型,2株为GⅡ/11型,1株为GI/4型,2株为GI/5型,3株为GI/6型。 2010年深圳地区诺如病毒的主要型别是GI和GⅡ,并且以GⅡ/4型为主,流行优势株为GⅡ/4（2006b）。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。