戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

核酸恒温扩增技术研究进展

核酸恒温扩增技术在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。我们对核酸恒温扩增技术的最新进展作一简要综述,包括环介导恒温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增、转录依赖的扩增、杂交捕获法、转录介导的扩增等的原理、优缺点及应用。     

核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用

目的:建立快速、简便和特异的检测转EPSPS基因作物的方法。方法:针对转EPSPS基因作物外源基因cp4-EPSPS的8个区域,设计2对特异性引物和1对环引物,对反应体系中的MgSO4、内引物、环引物、甜菜碱、dNTP浓度和反应温度等条件分别进行优化,并用核酸试纸条对扩增产物进行检测,建立用于检测转EPSPS基因作物的环介导等温扩增方法(LAMP)。结果:用建立的LAMP方法检测转EPSPS基因作物时,在64℃恒温反应30 min,即可根据试纸条显色直接观察结果;该方法具有高度特异性,可检测到10个拷贝的EPSPS DNA。结论:LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测转EPSPS基因作物,在基层和实验室都具有良好的应用前景。     

禽副粘病毒-2 膜融合相关多肽基因的构建与表达

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步 . 禽副粘病毒 -2 (APMV-2) 囊膜表面糖蛋白有 2 种,与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶 (HN) 及介导膜融合的融合糖蛋白 (F). HN 蛋白的茎部区域 (stalk region) 与球状头部区域 (globular head region) ,以及 F 蛋白的 3 段七肽重复区域 (heptad repeat , HR) 都可能与膜融合直接相关,将 5 段多肽进行基因的构建与表达研究 . 根据已发表的禽副粘病毒 -1 (APMV-1) 氨基酸序列,应用 BLAST 程序进行同源性分析,以确定 APMV-2 相应区域,使用搭桥 PCR 或普通 PCR 方法构建基因,分别克隆入表达载体 pGEX-6p- Ⅰ获得重组质粒,阳性重组质粒转化入大肠杆菌 BL21 (DE₃) ,表达后获得可溶性融合蛋白, 3C 蛋白酶酶切后的蛋白质混合物经 Glutathione-Sepharose 4B 亲和层析纯化,最终获得可溶性、高纯度的 5 段多肽 . 应用 LearnCoil-VMF 软件与 ExPASy 系列软件对蛋白质结构与功能进行预测与分析 . 分子筛实验结果表明, F 蛋白的 HR1 与 HR2 可形成六聚体结构,圆二色谱实验结果则表明,六聚体蛋白富含 α 琢螺旋结构 .     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。